寨卡病毒(Zika virus)是近年兴起一种的与登革热、日本脑炎、西尼罗河热病毒等高度相似的虫媒黄病毒。该病毒是一种单链的RNA病毒,基因组全长11 kb,编码3个结构蛋白(C、prM/M和E),及7个非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)。ZIKV在全球的大规模爆发,导致包括成人格林-巴利综合征和新生胎儿的先天性畸形等严重疾病。据统计,全球大约有150万人确认感染ZIKV,超过46个国家发现ZIKV自然感染病例。然而,针对ZIKV的特效药物和疫苗仍在开发。因此,快速、准确地对ZIKV感染者进行确诊,对有效控制疫情,及时治疗尤为重要。非结构蛋白1(Nonstructural protein 1)作为病毒唯一分泌并与宿主相互作用的重要蛋白,在病毒感染、复制及免疫逃逸过程中起着重要作用。NS1蛋白在细胞内形成同源二聚体,与胞内膜系统的脂类结合,参与病毒复制,并以可溶性的形式分泌于细胞外。此外,NS1蛋白作为抗原,可诱导机体产生抗体,是病毒早期诊断的重要标志物。因此,开发基于ZIKV-NS1蛋白的检测试剂盒,对ZIKV的临床诊断和治疗具有重要实际应用价值。本课题主要的研究内容和结果如下:第一部分:重组ZIKV-NS1蛋白的表达与纯化。利用primer 5软件,根据NCBI中检索出的ZIKV-NS1蛋白基因序列,设计出一对特异性引物,并在上下游引物两端分别加上EcoR I和Xho I两种酶切位点。通过PCR扩增将目的基因插入pET-32a表达载体,通过菌液PCR验证和DNA测序分析,将构建好的重组质粒转到大肠杆菌宿主细胞,进行重组蛋白的诱导表达。将诱导后的菌液进行蛋白可溶性分析,SDS-PAGE结果表明重组蛋白在包涵体中大量表达。利用8M尿素处理包涵体,用镍柱进行重组蛋白纯化。然后通过透析进行蛋白复性,得到了重组ZIKV-NS1蛋白。通过SDS-PAGE和Western blot实验来验证重组ZIKV-NS1蛋白的表达,其蛋白分子量为58 KD。第二部分:单克隆抗体的制备。将纯化的重组ZIKV-NS1蛋白作为抗原,免疫小鼠。加强免疫后,将小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合。融合后的细胞用HAT培养基进行阳性杂交瘤细胞的筛选,一周后更换HT培养基。采用间接ELISA法和间接免疫荧光法(IFA)检测杂交瘤上清液中ZIKV-NS1蛋白的特异性抗体。经过三轮亚克隆后,共获得十四株稳定分泌抗ZIKV-NS1蛋白抗体的杂交瘤细胞株。第三部分:使用杂交瘤细胞株进行腹水的制备,并通过ELISA、Western blot、IFA验证抗体活性,证明所制备的抗ZIKV-NS1蛋白小鼠单克隆抗体能够识别天然NS1蛋白。随后,将制备的14株ZIKV-NS1单抗腹水分别进行纯化,并标记辣根过氧化物酶(HRP),建立高灵敏度(120 ng/mL)的DAS-ELISA来快速准确的检测感染ZIKV的树鼩(Tupaia belangeri)血清中的ZIKV-NS1蛋白,以及非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)、幼地鼠肾细胞(BHK细胞)的培养上清中的ZIKV-NS1蛋白。本研究表达纯化大量ZIKV-NS1蛋白,并在此基础上成功制备出能够特异性识别ZIKV-NS1蛋白的小鼠单克隆抗体和兔多克隆抗体。通过亲和力测定和抗体配对实验选择兔多克隆抗体(R1)抗体作为捕获抗体,小鼠单克隆抗体(1F12-HRP)为标记抗体,建立DAS-ELISA检测方法。本实验所建立的DAS-ELISA方法无需病毒分离、培养以及RNA的提取,可直接作为高通量检测ZIKV感染的主要筛查方法,提高对ZIKV的检出率,为有效地控制疫情、及时治疗提供有力保障。