研究背景与目的脊髓损伤（spinal cord injury,SCI）是一种致残性极高的中枢神经系统（central nervous system,CNS）疾病,常导致患者损伤平面以下不同程度和类型的神经功能障碍。这些功能障碍不仅给患者的生活带来难以承受的痛苦,也给家庭和社会造成沉重的经济负担。因此,如何促进患者受损的神经功能最大程度地恢复,尤其是运动功能,是目前SCI研究亟待解决的问题。虽然近些年对SCI的致伤机制以及针对某些机制的治疗研究有了一定的进展,但目前对于SCI后的运动功能恢复临床上仍缺乏有效的治疗方式。纵观既往关于SCI的研究,绝大部分都着眼于损伤脊髓的局部。但有趣的是,课题组前期的临床研究发现SCI除了导致损伤脊髓局部的病理损伤之外,还会导致大脑运动皮层发生萎缩。而且运动皮层萎缩越严重,患者运动功能恢复情况就越差。这可能是由于SCI后运动皮层神经元发生死亡,并最终导致运动皮层结构萎缩。而运动皮层神经元的死亡不可避免地导致其相关轴突（皮质脊髓束）的损伤,进而限制针对损伤脊髓局部治疗的效果。因此,以运动皮层神经元死亡为靶点可能为SCI治疗提供新的策略。但目前对于SCI导致运动皮层神经元死亡的具体方式和机制都尚不清楚。2012年Dixon等报道了一种全新的细胞程序性死亡方式。其特点是由高度铁依赖性的脂质过氧化作用所驱动,因此被命名为“铁死亡”（ferroptosis）。后续的研究报道铁死亡在包括神经退行性疾病在内的多种中枢神经系统疾病的发病中也起到重要的作用。而我们前期的动物实验发现,SCI会导致包括运动皮层在内的多个脑区发生铁超载。这就提示我们铁死亡很可能参与SCI后运动皮层神经元的死亡。然而目前关于临床SCI患者运动皮层是否也有铁超载现象?SCI后运动皮层铁超载随时间的变化规律如何?SCI是如何导致运动皮层发生铁超载?以及运动皮层铁超载是否会触发神经元发生铁死亡都不得而知。鉴于此,本研究拟首先通过分析临床SCI患者的运动皮层磁敏感加权成像（Susceptibility weighted imaging,SWI）资料明确SCI患者运动皮层的铁超载情况,并进一步通过建立大鼠SCI模型动态观察运动皮层铁含量的变化规律,在此基础上再利用在体动物实验和离体细胞实验探究SCI导致运动皮层铁超载的具体机制,以及运动皮层铁超载是否会导致神经元发生铁死亡,以期为SCI的临床康复治疗探索新的有效靶点。材料与方法1.脊髓损伤对运动皮层铁含量的影响研究本实验研究分为两个部分:第一部分为采集17名SCI患者和16名性别、年龄相匹配的健康对照者的头颅高分辨率SWI数据,将双侧初级运动皮层作为感兴趣区域,运用SPIN软件对感兴趣区域的相位值进行测量分析,最后将相位值换算成弧度值进行统计分析;另一部分为分别在建立SCI模型后1天、1周、2周和4周取大鼠初级运动皮层脑组织标本进行铁含量检测。2.脊髓损伤后运动皮层铁超载的机制研究本实验内容分为三个部分。第一部分,随机将实验大鼠分为以下4个组:Sham组（假手术组）、SCI组（SCI模型组）、Vehicle组（SCI后给予生理盐水治疗）、Mino组（SCI后给予米诺环素治疗）,于SCI后28天取初级运动皮层脑组织行免疫荧光和Western blot检测;第二部分,实验大鼠被随机分为以下5个组:Sham组、SCI组、Vehicle组、Mino组和L-NAME组（SCI后给予L-NAME治疗）,于SCI后28天行Basso,Beattie and Bresnahan（BBB）评分以评估运动功能恢复情况,随后取初级运功皮层脑组织行一氧化氮（nitric oxide,NO）含量检测和运用Western blot检测铁代谢相关蛋白的表达情况。第三部分,在体外分离培养皮层原代神经元,利用NO供体DETA NONOate干预原代神经元后,采用Western blot法检测神经元内铁代谢相关蛋白的表达情况。3.脊髓损伤后运动皮层铁超载致神经元发生铁死亡的机制研究本实验内容分为两个部分。第一部分,实验大鼠被随机分成5个组:Sham组（假手术组）、Vehicle组（SCI后给予0.01%DMSO治疗）、DFO组（SCI后给予去铁胺（deferoxamine,DFO）治疗）、NAC组（SCI后给予N-acetylcysteine（NAC）治疗）和Fer-1组（SCI后给予铁死亡抑制剂ferrostatin-1（Fer-1）治疗）,分别于SCI后1天、1周、2周、3周、4周按照Basso,Beattie and Bresnahan（BBB）评分量表进行后肢运动功能评分,于SCI后4周行下肢神经电生理检测,随后取大鼠初级运动皮层脑组织行流式细胞术检测ROS含量,行丙二醛（malondialdehyde,MDA）检测以评估脂质过氧化情况,行透射电镜观察神经元线粒体形态,行q RT-PCR检测铁死亡相关基因表达情况,行尼氏染色并对初级运动皮层神经元进行计数。第二部分,体外分离培养皮层原代神经元并给予枸橼酸铁铵（ferric ammonium citrate,FAC）处理构建铁超载模型,并分别给于DFO、NAC或者Fer-1治疗,运用流式细胞术检测各组神经元ROS含量和脂质过氧化情况,运用透射电镜观察各组神经元线粒体形态,运用q RT-PCR检测不同处理组的神经元内铁死亡相关基因的表达情况。结果1.脊髓损伤对运动皮层铁含量的影响研究1.1通过分析高分辨率SWI数据我们发现与健康对照者相比,SCI患者初级运动皮层的相位值显著升高。1.2 SCI后大鼠初级运动皮层的铁含量随着时间逐渐增加,且均明显高于假手术组。2.脊髓损伤后运动皮层铁超载的机制研究2.1 SCI后大鼠初级运动皮层有明显的小胶质细胞活化,而给予米诺环素治疗能显著减轻小胶质细胞活化情况。2.2 SCI后大鼠初级运动皮层活化的小胶质细胞分泌大量的NO,而给予米诺环素或一氧化氮合酶抑制剂L-NAME治疗均能显著减少NO含量。2.3 SCI后大鼠初级运动皮层iron regulatory protein 1（IRP1）、divalent metal transporter 1（DMT1）、transferrin receptor 1（Tf R1）的表达量增加,而ferritin的表达量降低,ferroportin1（Fpn1）的表达量没有显著变化。而给予米诺环素或一氧化氮合酶抑制剂L-NAME治疗均能显著减少IRP1、DMT1和Tf R1的表达量,增加ferritin的表达量。2.4 SCI后大鼠后肢运动功能显著障碍,而给予米诺环素或一氧化氮合酶抑制剂LNAME治疗均能显著改善实验大鼠后肢运动功能。2.5离体的细胞实验显示,NO能显著上调神经元IRP1、DMT1和Tf R1的表达量,并显著下调ferritin的表达量,但对Fpn1的表达量没有显著影响。3.脊髓损伤后运动皮层铁超载致神经元发生铁死亡的机制研究3.1 SCI后大鼠初级运动皮层ROS含量显著增加,进而导致明显的脂质过氧化;而给予DFO、NAC或者Fer-1治疗均能显著减少ROS的生成,并缓解脂质过氧化程度。3.2 SCI后大鼠初级运动皮层神经元的线粒体形态发生异常改变,表现为皱缩或者线粒体嵴减少;而给予DFO、NAC或者Fer-1治疗均能显著缓解初级运动皮层神经元的线粒体形态异常改变。3.3 SCI后大鼠初级运动皮层与铁死亡相关的基因表达紊乱,表现为Ptgs2表达上调、Gpx4表达下调、而Fsp1表达没有显著性差异;而给予DFO、NAC或者Fer-1治疗均能显著抑制Ptgs2的表达、上调Gpx4的表达。3.4 FAC干预能导致原代神经元内大量的ROS产生,而堆积的ROS会进一步造成脂质过氧化;而给予DFO、NAC或者Fer-1治疗均能显著减少FAC引起的ROS产生,并缓解脂质过氧化。3.5 FAC干预能导致原代神经元内大量线粒体形态发生形态异常改变,表现为皱缩或者线粒体嵴减少;而给予DFO、NAC或者Fer-1治疗均能显著缓解FAC引起的线粒体形态异常改变。3.6 FAC干预能导致原代神经元与铁死亡相关的基因表达紊乱,表现为Ptgs2表达上调、Gpx4表达下调、而Fsp1表达没有显著性差异;而给予DFO、NAC或者Fer-1治疗均能显著抑制Ptgs2的表达、上调Gpx4的表达。结论1.SCI可导致大脑运动皮层发生明显的铁超载现象,并且铁超载呈现出随着时间逐渐加重的趋势。因此,运动皮层铁沉积可能是导致SCI后患者运动皮层结构与功能改变重要原因。2.SCI可引起大鼠初级运动皮层小胶质细胞活化,后者通过分泌过量NO造成神经元铁代谢相关蛋白表达量异常,进而导致运动皮层发生铁超载。3.SCI后运动皮层铁超载可引起神经元内大量的ROS堆积,进而导致脂质过氧化,造成神经元线粒体形态发生异常、铁死亡相关基因表达异常,并最终触发神经元发生铁死亡,阻碍SCI大鼠运动功能的恢复。