甘油脱氢酶(Glycerol dehydrogenase，GDH，EC1.1.1.6)是甘油代谢回路的关键酶之一，作用是催化甘油生成二羟基丙酮(Dihydroxyacetone，DHA)。DHA是一种水溶性的简单酮糖，一般以二聚体形式存在，是有机化学合成中非常重要的一类中间体。作为重要的化工、生化原料，DHA及其衍生物在精细化工、制药、食品、化妆品工业和水质净化等方面潜在广泛的应用前景。　　GDH隶属于第Ⅲ金属依赖型多元醇脱氢酶家族。该家族包括丁醇脱氢酶(butanol dehydrogenase，BDH)、乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase，ADH)、甲醇脱氢酶(methanol dehydrogenase，MDH)、4-氧代-2-己烯二酸还原酶(maleylacetatereductaseⅠ，MAR)、脱氢奎尼酸合成酶(dehydroquinate synthase，DHQS)等。其催化核心为某一金属离子以及若干与金属离子螯合的残基，催化机理为金属离子和与其螯合的残基分别与醇羟基的氧原子与氢离子作用，使羟基中O-H键断裂，释放质子，将羟基氧化为酮基或羰基。　　本研究利用分子模拟与同源建模手段，对GDH进行了理性设计改造，并探讨分析了相关设计对酶活的影响。本研究旨在提高GDH的酶活，以期探索一种有效的改造类似氧化还原酶的方法。所做具体工作如下:　　一、对GDH进行同源建模，分析其三维结构，找出可能的催化活性位点。参考近年文献中对相同催化机理氧化还原酶的理性设计方案，针对活性位点周围的残基进行突变，引入碱性残基，提高活性位点附近的电子云密度，设计出T1-T120H、T2-A122R、T3-G170H、T4-A172R、T5-A253R、T6-A255K、T7-Y270H、T8-G272R、T9-V275E、T10-K274R等十组突变位点。　　二、对GDH进行第一轮定点突变，构建BL21(DE3)/pET28a-T(n)表达体系。随后，对突变后的GDH进行表达纯化，并测定其酶活水平。第一轮突变中，酶的比活普遍提高，最高达到43 U/mg，约为突变前GDH比活的3倍。　　三、进行第二轮突变，将多个正突变叠加，构建多点突变表达体系。该轮突变中GDH比活较第一轮突变又有所提高。将3个突变叠加后，GDH比活最高达到85 U/mg，约为突变前GDH比活的5.8倍。　　四、对各突变GDH进行同源建模，并将构建的模型提交到PROPKA上，计算出各带电残基的pKa值。随后考察了活性残基pKa值与比活变化的相关性，发现Aspl21与His254两个残基的pKa值与比活为正相关，而Asp171的pKa值与比活为负相关。由此可以借此验证与修正关于GDH催化机理的猜想，并为该理性设计思路提供了理论依据。