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小麦蓝矮病（Wheat Blue Dwarf,简称WBD）是我国首次报道的小麦植原体病害,国外尚未见报道,由介体条沙叶蝉（Psammotettix striatus L.）专化性传播,是我国西北干旱、半干旱地区中熟麦区间作套种和麦草覆盖小麦生产中的主要流行性病害,该病发生严重时可使全田翻种绝收,给小麦粮食生产带来巨大的损失。胸苷酸激酶（Thymidylate kinase, TMK,国际系统命名:EC 2.7.4.9）,在ATP为供体和Mg2+参与的条件下,催化磷酰基从ATP转移到脱氧胸苷酸（deoxythymidylic monophosphate, dTMP）形成dTDP,是植原体细胞三磷酸胸苷（dTTP）补救合成途径的关键酶之一,用于DNA的合成、修复或线粒体DNA的复制。由于植原体在寄主体内含量低,又无法进行分离培养,致使对该病原物的研究受到了一定的限制,因此,本文用分子生物学方法从小麦蓝矮病植原体中将胸苷酸激酶基因（tmk）分离,进行原核表达,亲和纯化,并对纯化的融合蛋白进行了酶活性分析。研究结果如下:（1）小麦蓝矮病植原体胸苷酸激酶基因（tmk）的分离:设计特异性引物,采用分子生物学方法对陕西韩城自然发病的小麦蓝矮病植株进行植原体胸苷酸激酶基因（tmk）扩增,分离并克隆了2个tmk基因,tmk-1和tmk-2,全长分别为630bp和624bp,（G+C）含量分别为29.68 %和28.37 %,分别编码209和207个氨基酸。所测序列已被Genbank收录,其登录号分别为EU183350和EU183351。序列同源性分析表明, tmk-1基因与洋葱黄化（OY）的tmk-a、三叶草绿变（CPh）,tmk-2与洋葱黄化的tmk-b、翠菊黄化丛枝（AYWB）的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列同源率均达到94 %以上,说明小麦蓝矮病植原体与16SrⅠ组植原体亲缘关系较近。（2）胸苷酸激酶基因的结构特征:氨基酸序列的分析表明,WBD-TMK包含P-loop区、TMP结合区及LID区等3个与结合NTP/NMP相关的保守功能区,说明小麦蓝矮植原体TMK-1和TMK-2在一级结构上与已知TMK含有相同的功能区,由此推出它们可能行使同样的TMK酶催化功能。但在TMK-1序列中,TMP结合区上参与重要作用的DRY三肽中的Y被W取代,且P-loop区下游的和TMP结合区上游的N′- PAL -C′两个高度保守区的缺失,可能会对TMK-1的酶活性有一定影响。（3）胸苷酸激酶基因的原核表达:构建了pET30-tmk和pBV221-tmk重组质粒,并进行原核表达,SDS-PAGE分析表明tmk-1和tmk-2基因在大肠杆菌BL21（DE3）中均得到了高效表达。但pBV221- tmk重组质粒表达的蛋白全为包涵体形式存在,故选择pET30a原核表达载体。通过诱导温度和时间的优化,16℃诱导14h能产生较多的可溶性蛋白,可以满足后续实验。采用Ni-NTA进行亲和层析纯化,通过梯度洗脱,确定用含500mM咪唑的Elution Buffer洗脱收集目的蛋白。（4）酶活性分析:结果表明TMK-2融合蛋白活性较高,在酶浓度为211μg/ml时达到最高,酶活力为112.41 U/mg,该酶最适催化条件为1.5 mmol/L Mg2+,1 mmol/L ATP ,pH7.3左右,温度32℃左右。TMK-1融合蛋白催化活性极低,酶活力仅1.64 U/mg,且其催化活性不随六种影响因素梯度改变而变化。利用凝血酶将融合蛋白N端的His标签切去后,酶活性无太大变化,说明融合蛋白N端的His标签部分对TMK-2的活性没有影响,且并未抑制TMK-1的活性。分析原因可能是TMK-1反应的最适条件与TMK-2不同,或者TMK-1可能作为另外一种激酶起作用。另外,从DNA序列上分析, P-loop区下游的TKEPGG和TMP结合区上游的PAL,这2个高度保守区的缺失,很可能削弱了TMK-1催化活性。