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高三尖杉酯碱（Homoharringtonine，HHT）是从我国特有植物海南粗榧分离出来的一种有效抗癌药物。我国在世界上首先用于急性非淋巴细胞白血病（ANLL）治疗，并取得显著疗效。本研究探索HHT体外诱导原代急性白血病（AL）细胞凋亡与临床疗效的关系，HHT促凋亡过程中，可能与端粒酶逆转录酶（hTERT）、端粒酶和凋亡相关基因survivin表达密切相关。 本研究采用MTT法研究HHT对37例初发AL细胞（ALL 11例，ANLL 26例）体外培养15小时的抑制作用。结果发现：HHT对ALL细胞抑制率明显低于ANLL细胞（19.68±18.83对34.92±19.58，P＜0.05）。37例AL患者（除外M3）中20例可资评价临床疗效，采用TUNEL法检测HHT的促凋亡作用，结果发现，HHT诱导ALL细胞凋亡率略低于ANLL细胞（17.34±9.60对26.64±20.67，P＞0.05）。原代AL细胞体外凋亡率（根据化疗方案取HA或DA，ALL患者取DNR）与骨髓原始细胞减少指数（MBDI）密切相关（γ=0.586，P＜0.01）。AL细胞体外凋亡率中位值为27.6％，AL细胞体外凋亡率＞27.6％者，CR率为80.0％（8/10），凋亡率＜27.6％者，CR率为30％（3/10），差异具有统计学意义（P=0.03）。采用HA方案化疗患者中，体外调亡率＞27.6％的患者，CR率也高于凋亡率＜27.6％的患者[80.0％（4/5）对25.0％（1/4）]。表明AL细胞体外凋亡率与体内疗效基本一致，体外凋亡率可以做为预测AL疗效的指标之一。 本研究采用半定量RT-PCR方法检测30例初发AL，12例AL获CR患者、6 浙江大学博士学位论文例正常人骨髓细胞hTERT mRNA的表达。结果显示：初发AL细胞hTERT mRNA表达量为0．71士0．34，明显高于＊组的hTERTmRNA表达量0．43士0．25（P＜0．05）及正常骨髓细胞hTERT mRNA达量0．22士0．21（P＜0．01）。采用端粒重复序列扩增法（TRAP）－酶联免疫吸附试验（ELISA）检测端粒酶活性，结果显示 30例初发 AL细胞端粒酶活性明显高于12例CR 患者（0．235士0，395 对0．012士0．015，P＝0．007）。30 例初发 AL 细胞 hTERT mRNA 表达量与端粒酶活性呈正相关 （r＝0．421，p＜0．of）。结果表明端粒酶活性与hTERT表达相关。 本研究结果还显示：HHT能够下调 hTERT mRNA表达。不同浓度 HHT作用 HL60细胞 12小时，与空白对照比较，HHT浓度在 0刀05ug／ffil－0．03t。g／ffil之间对 HL60细胞 hTERT mRNA表达无明显影响，HHT浓度增至 0刀4ugiml－0．05ug／ml，hTERTmRNA表达量明显下降至检测不出。0刀Zug／ml HHT作用 HL60细胞不同时间后，开始 6小时内 hTERT mRNA表达无明显变化，＞6 ’J’时后，hTERT mRNA表达量呈下降趋势，18小时后明显下降，至 30小时未能检出 hTERTmRNA的表达。结果显示，HHT能够下调hTERT mRNA表达，但需一定的浓度和作用时间。与此同时研究了HHT对HL60细胞端粒酶活性和凋亡的影响，显示HHT能使HL60细胞端粒酶活性－卜降，其下降趋势与 hTERT mRNA表达基本一致，且随 hTERT mRNA转录水平和端粒酶活性下降，HL60细胞凋亡率明显增加。推测下调白血．病细胞hTERT转录和端粒酶活性可能是HHT诱导白血．病细胞凋亡的原因之一。 HHT诱导原代AL细胞凋亡与抗凋亡基因 survivn mRNA表达有关。本研究采用RT－pCR方法检测初发AL细胞suvivin mRNA表达。结果发现：survivin mRNA在AL细胞阳性率为82．口％（41乃0），明显高于正常对照33．3％（2峋（P＜0刀5）；其表达强度也高于正常对照（0．45上0．27 对 0．11士0．17，P二0．004）。ANLL各亚型中，叭细胞survivin mRNA表达阳性率明显低于 M；＿。和 M。＿。…值分别为 0．of，0．035）。survivin mRNA阴性的患者接受一个疗程的化疗后骨髓缓解率（BMR）明显高于阳性组【83．3％(5／幻 对25．0％（4／16），P＝0．0231。体外实验表明，1 例survivin mRNA阴性表达的AL细胞对HHT诱导凋亡率，均高于14例阳性表达者。体内疗效显示，13例接受HA方案化疗患者中，survivin mRNA阴性表达者BMR率高于阳性表达者［100％（2／2）对 27．3％（3／11）］。推测：AL细胞 survivin mRNA表达可能是其对HHT诱导凋亡不敏感的原因之一，未见相关文献报道。 2 浙江大学博士学位论文 综上所述，本研究认为：（）HHT对原代 ALL细胞和 ANLL细胞均有抑制作用和诱导凋亡作用。（）AL细胞体外凋亡率与 MBDI相关，可以作为预测 AL临床疗效的指标之一。（）原代 AL细胞 hTERT mRNA表达与端粒酶活性相关，AL获 CR后，hTERT和端粒酶活性同步下降，国内未见相关文献。（4）HHT能够诱导 HL60细胞hTERT mRNA表达水平和端粒酶活性下降（未见相关文献）。诱导hTERT表达下降可能是HHT诱导白血病细胞凋亡原因之一。（5）本研究首次发现抗凋亡基因survivin mRNA在AL细胞高表达。survivin mRNA高表达可能是AL细胞对HHT诱导凋亡不敏感的原