研究背景和目的系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus, SLE)是一种以大量自身抗体形成为特征的慢性自身免疫性疾病,该病临床表现复杂,累及全身各大系统,病程迁延,严重危害人类健康。SLE的病因较为复杂,发病机制至今尚未完全明了,细胞免疫调节异常是发病机制中的主要环节,尤其是淋巴细胞的活化以及一系列炎症细胞因子的产生均可导致补体激活、免疫复合物的沉积和靶器官的细胞浸润,在SLE的发病中起着重要作用。调节性T细胞是机体维持自身免疫耐受和调节各种免疫应答的重要细胞,在SLE以及类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis, RA)等自身免疫性疾病的免疫调节中发挥着重要作用。调节性T细胞具有多种表型,其中,TCRαβ+CD4-CD8-即双阴性T细胞(Double negative T cells, DNT细胞)是一类新发现的调节性T细胞,正常情况下,DNT细胞在外周血淋巴细胞中的比例仅占1%左右。国外有研究显示DNT细胞在系统性红斑狼疮患者外周血中显著增加,并且增加的DNT细胞具有炎症细胞的表型,在疾病的发病机制中起着重要作用。台湾学者发现在中国的SLE患者外周血中DNT细胞也有升高的趋势,但与正常对照者相比差异无统计学意义。我们前期通过小样本研究发现SLE患者外周血中DNT细胞显著增加,并与疾病发生发展相关。因此,在本研究中我们将通过进一步扩大样本量来加以证实,并寻找SLE患者DNT细胞与疾病发生发展之间的相关性。SLE患者中DNT细胞增加的机制目前尚不清楚。Fas途径是体内维持T细胞平衡的关键调节者,在维持DNT细胞在组织中的正确分布起着重要的作用。细胞表面Fas受体的表达率降低会导致该细胞对Fas介导的凋亡敏感性降低,从而逃逸Fas-FasL途径介导的凋亡。SLE患者中升高的DNT细胞是否是由于其表面Fas受体的表达率降低所致,以及DNT细胞表面Fas受体的表达是否与疾病活动性有关,目前尚未见相关报道。有关DNT细胞功能,目前研究较多的是DNT细胞的免疫抑制作用。然而,研究者发现在SLE患者中增加的DNT细胞可通过与B淋巴细胞的相互作用促进自身抗体的产生,在狼疮肾炎的发病机制中起关键作用。此外,在狼疮小鼠模型中也发现DNT细胞显著增加,分泌大量的IL-17,并且与疾病的严重性呈显著地正相关关系。白细胞介素-17(Interleukine-17, IL-17)是由活化的T淋巴细胞产生的炎性细胞因子。研究证实IL-17在慢性炎症时可导致组织损伤,在SLE的炎症反应中扮演着重要角色。目前为止,国外仅有一篇文献报道SLE患者外周血中的DNT细胞可以分泌细胞因子IL-17,并在肾组织的活检标本中证实有DNT细胞与IL-17的沉积,并认为DNT细胞及其分泌的细胞因子IL-17在狼疮肾炎的发病中起重要作用,国内尚无相关文献报道。研究目的目前,虽然对SLE的研究众多,但是SLE的发病机制仍然没有阐明,SLE中DNT细胞增加的原因仍不清楚,有关SLE患者中DNT细胞功能方面的研究甚少,因此深入了解DNT细胞在SLE中的作用及作用机制对SLE发病机理的研究具有重要意义。本课题结合国内外研究进展和我们前期的工作,分别以SLE患者、RA患者以及正常对照者为研究对象,观察各研究对象中DNT细胞数量的变化及其表面Fas受体表达的情况,探讨DNT细胞与Fas介导的凋亡敏感性的关系,从而探讨SLE患者中DNT细胞增加的原因及其与疾病的相关性；通过检测SLE患者和正常对照者外周血各T细胞亚群在不同条件刺激下细胞因子IL-17的分泌情况,证实DNT细胞在SLE患者炎症反应中的作用及作用机制,为SLE的发病机制的研究提供新的理论依据和实验基础,从而为SLE的诊断和治疗开辟新的思路。研究方法1研究对象病例组：随机选择2011年5月至2012年1月南方医科大学南方医院确诊为SLE的56例患者作为病例组,其中男性3例,女性53例,平均年龄为28.07±10.84岁。所有纳入的患者均符合美国风湿病学会(ACR)1997年推荐的SLE的分类标准,并除外感染、原发性心、肝、肾等器质性病变以及合并其他自身免疫病史等。采用系统性红斑狼疮疾病活动指数评分(Systemic lupus erythematosus disease activity index, SLEDAI)对患者进行疾病活动性评估,根据0-4分为基本无活动,5-9分为轻度活动,10-14分为中度活动,≥15分为重度活动,结合我们的研究目的,将评分<10分定义为缓解期,≥10分定义为活动期。1.1疾病对照组：根据美国风湿病学会(ACR)1987年修订的RA的分类标准,选取同期南方医科大学南方医院确诊为RA的25例患者作为疾病对照组,其中男性2例,女性23例,平均年龄为32.56±4.22岁。除外感染、原发性心、肝、肾等器质性病变以及合并其他自身免疫病史等。1.2正常对照组：随机选取同期南方医科大学南方医院27例健康查体者作为正常对照组,平均年龄32.37±10.02岁,其中男性2例,女性25例,均排除感染、原发性的心、肝、肾等器质性病变以及自身免疫病史等。三组年龄、性别之间均无显著性差异。2研究方法2.1采用多色流式细胞术分别检测56例SLE患者、25例RA患者以及27例正常对照者外周血DNT细胞的比例以及其表面Fas受体的表达情况将用于标记的荧光抗体和相应的同型对照分别置于流式管底部,分别加入适量全血,轻轻混匀,避光孵育、溶血、洗涤细胞后,PBS重悬细胞,采用BDFACS-Calibur流式细胞仪进行检测,计数至少10万个细胞,以FSC/SSC二维散射光设门圈定淋巴细胞群,利用BD公司Cell Quest软件进行参数获取和数据分析,检测外周血中DNT细胞以及表面Fas受体的表达情况。2.2采用多色流式细胞术分别检测13例SLE患者以及7例正常对照者全血中各T淋巴细胞亚群胞内的细胞因子IL-17的表达情况取适量肝素钠抗凝全血,加入RPMI1640全培,混匀后加入佛波酯(Phorbol myristate acetate, PMA)、钙离子导入剂(Ionomycin)联合刺激以及布雷菲德菌素A(Brefeldin A, BFA)进行阻断,在37℃、5%CO2培养箱中培养5个小时后收集细胞,离心后去上清,混匀,进行表面染色、固定、破膜和胞内染色。采用BDFACS-Calibur流式细胞仪检测全血中各淋巴细胞亚群的比例以及其胞内细胞因子IL-17的表达。2.3采用多色流式细胞术分别检测13例SLE患者以及7例正常对照者分离的外周血单个核细胞在有或无anti-CD3刺激培养5天后各T淋巴细胞亚群胞内细胞因子IL-17的表达情况采用梯度密度离心法分离外周血单个核细胞,调整细胞浓度后接种到预先包被好anti-CD3的12孔培养板中,在37℃、5%CO2的培养箱中培养5天。在收集细胞前的5个小时加入PMA、Ionomycin以及BFA阻断剂培养刺激,收集细胞,离心去上清,混匀后进行表面染色、固定、破膜和胞内染色。采用BDFACS-Calibur流式细胞仪分别检测在有或无anti-CD3刺激培养5天后外周血单个核细胞中各T淋巴细胞亚群比例以及胞内细胞因子IL-17的表达情况。3.统计方法应用SPSS13.0统计学软件进行分析。所有计量资料均采用χ±s表示,数据经检验不满足正态性和(或)方差齐性,两独立样本均数比较采用Mann-WhitneyU检验,两配对样本比较采用Wilcoxon符号秩和检验,相关性采用spearman相关以及偏相关进行分析,多个独立样本比较采用Kruskal-Wallis H检验,其中两两比较用Bonferroni法。取α=0.05为检验标准,Bonferroni法以调整后的α=0.05／3=0.017为检验标准。结果1.SLE患者外周血中DNT细胞的比例及其与疾病活动性的相关性1.1外周血DNT细胞占TCRαβ+细胞比例的比较中,SLE、RA、NC三组总体比较有显著性差异(P<0.001)。其中,SLE组DNT细胞的比例显著高于正常对照组(2.45±1.45vs.1.08±0.62,P<0.001)；与RA组比较,SLE组DNT细胞的比例显著增高(2.45±1.45vs.1.57±0.98,P=0.002),RA组与NC组之间比较,差异无统计学意义。1.2SLE患者外周血中的DNT细胞与疾病活动的相关性分析显示,初发患者的DNT细胞高于复查患者；活动期SLE患者外周血DNT细胞显著高于缓解期患者；SLE患者中补体降低组的DNT细胞比例显著高于补体正常组。SLE患者外周血DNT细胞与自身抗体的水平之间无显著相关性,与系统性红斑狼疮疾病活动指数(SLEDAI)之间呈正相关关系(r=0.376,P=0.005)。2.SLE患者外周血DNT细胞表面Fas受体的表达与疾病活动性的相关性2.1外周血DNT细胞表面Fas受体表达的比较中,SLE、RA、NC三组总体比较具有显著性差异(P=0.015),其中,SLE组与正常对照组相比,SLE组外周血DNT细胞表面Fas受体的表达显著增加(1.44±0.91vs.0.91±0.55,P=0.004),SLE组与RA组相比,差异无统计学意义；RA组与正常对照组相比,差异无统计学意义。2.2外周血DNT细胞表面Fas受体表达率的比较中,SLE、RA、NC三组总体比较具有显著性差异(P<0.001)。其中,SLE组与正常对照组相比,SLE组DNT细胞表面Fas表达率显著降低(61.39±19.20vs.75.95±8.88,P<0.001)；SLE组与RA组相比,SLE组DNT细胞表面的Fas表达率也显著降低(61.39±19.20vs.74.11±12.82,P=0.004)。RA组与正常对照组相比,差异无统计学意义。2.3SLE患者DNT细胞表面Fas受体的表达与患者疾病活动性的关系分析中,SLE患者DNT细胞表面Fas受体的表达与DNT细胞的比例呈显著正相关关系(r=0.796,P<0.001)；SLE患者中补体降低组的DNT细胞表面Fas受体表达显著高于补体正常组；SLE患者DNT细胞表面Fas受体的表达与疾病活动指数(SLEDAI)之间存在显著正相关关系(r=0.332,P=0.014)。SLE患者DNT细胞表面Fas受体表达率与抗双链DNA抗体以及抗核抗体水平之间均存在负相关关系,但与SLEDAI相关性不显著。3.不同刺激下,各T细胞亚群的比例及其分泌IL-17比例及SLE患者中DNT细胞分泌的IL-17与疾病活动性的相关性3.1经过5小时培养刺激后,SLE患者全血中的总T细胞(TCRαβ+细胞)比例与正常对照组之间差异均无统计学意义,TCRαβ+细胞分泌的IL-17显著高于正常对照组(1.22±0.74vs.0.42±0.29,P=0.030)；CD4+CD8-细胞比例显著低于对照组(37.22±7.02vs.45.80±6.99,P=0.019)。CD4+CD8-细胞分泌的IL-17与正常对照组之间的差异无统计学意义；CD8+CD4-细胞比例及其分泌的IL-17与正常对照组之间差异均无统计学意义；DNT细胞的比例显著高于正常对照组(4.76±1.15vs.1.80±0.62,P<0.001),DNT细胞分泌的IL-17显著高于正常对照组(0.42±0.31vs.0.03±0.02,P<0.001)。3.2经过5天无anti-CD3刺激培养后,SLE患者的TCRαβ+细胞、CD4+CD8-细胞以及CD8+CD4-细胞比例与正常对照组之间均差异无统计学意义；DNT细胞比例显著高于正常对照组(7.83±1.71vs.1.97±0.88,P<0.001)。SLE患者外周血单个核细胞中的以上四种细胞分泌的IL-17均显著高于正常对照组(P均<0.05)。3.3经过5天有anti-CD3刺激培养后,SLE患者的TCRap+细胞以及CD8+CD4-细胞与正常对照组相似,CD4+CD8-细胞比例低于正常对照组(44.11±9.21vs.57.14±9.97,P=0.014)；DNT细胞比例显著高于对照组(16.94+4.43vs.5.74±2.35,P<0.001)。SLE患者TCRaβ+细胞分泌的IL-17显著高于正常对照组(0.73±0.22vs.0.42±0.18,P=0.008)；CD4+CD8-细胞以及CD8+CD4-细胞分泌的IL-17与正常对照组相比差异均无统计学意义；DNT细胞分泌的IL-17显著高于正常对照组(1.50±0.90vs.0.64±0.50,P=0.024)。3.4SLE患者在有或无anti-CD3刺激的比较中,有anti-CD3刺激组的CD4+CD8-细胞比例低于无刺激组(44.11±9.21vs.48.50±13.03,P=0.028),有anti-CD3刺激组的DNT细胞比例显著高于无刺激组(16.94±4.4vs.37.83±1.71,P=0.001)。有刺激组的CD4+CD8-细胞分泌的IL-17低于无刺激组(0.46±0.17vs.0.68±0.31,P=0.028),有anti-CD3刺激的DNT细胞分泌的IL-17显著高于无刺激组(1.50±0.90vs.0.67±0.40,P=0.002)。3.5在anti-CD3刺激培养5天的条件下,SLE患者DNT细胞分泌的IL-17与疾病活动性的相关性分析中,补体降低组的DNT细胞分泌的IL-17显著高于补体正常组,活动期患者的DNT细胞分泌的IL-17显著高于缓解期患者。SLE患者DNT细胞分泌的IL-17与抗双链DNA抗体以及抗核抗体的水平之间无显著相关性,与SLEDAI之间呈显著的正相关关系(r=0.573,P=0.041)。结论1.SLE患者外周血DNT细胞比例显著高于RA患者以及正常对照者,活动期SLE患者的DNT细胞显著高于缓解期患者,且DNT细胞的比例与疾病活动指数之间呈现正相关关系,表明DNT细胞的升高与疾病的发生发展密切相关,DNT细胞可能参与了SLE的发病。2.SLE患者外周血DNT细胞表面的Fas表达率显著低于RA患者以及正常对照者,表明DNT细胞对Fas介导的凋亡敏感性降低,可能是DNT细胞增加的原因之一。DNT细胞表面Fas受体的表达显著高于正常对照者,并与疾病活动密切相关,表明DNT细胞表面Fas受体的表达在一定程度上可以反映SLE患者疾病的活动性。3.SLE患者DNT细胞分泌的IL-17显著高于正常对照组,在anti-CD3刺激后,DNT细胞能迅速增殖,产生大量IL-17,并与疾病活动性密切相关,表明SLE患者中的DNT细胞可能通过分泌IL-17参与患者的炎症反应,诱导疾病的发生,刺激后DNT细胞分泌的IL-17可以作为评价SLE患者疾病活动性的候选指标。