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肌生成抑制素(Myostatin,MSTN)又称为GDF-8,是骨骼肌生长发育的负调控因子,是转化生长因子-β(TGF-β)超家族成员。MSTN主要在成年动物的骨骼肌中表达,它的缺失及敲除可以促进肌肉生长和体重增加,使肉牛具有双肌表型。但有关牛MSTN原核表达产物用于免疫动物以促进肌肉生长和体重增加的研究尚缺乏报道。为此,本试验对牛MSTN功能基因进行原核表达,并利用表达产物免疫小白鼠来研究牛.MSTN功能基因对动物的促生长作用,为进一步开发和利用MSTN功能基因提供参考。
以西门塔尔杂交牛骨骼肌细胞的总RNA为模板,利用RT-PCR技术扩增出牛肌生成抑制素(MSTN)功能基因片段,并与pMD-18T载体相连接,转化E.coli DH5α感受态细胞。通过PCR、酶切鉴定筛选阳性克隆,并进行序列分析。测序结果表明:RT-PCR扩增出的MSTN功能基因序列全长507bp,编码169个氨基酸,构建的牛pMD-18T-MSTN克隆质粒结果与设计一致。在获得牛MSTN功能基因克隆质粒pMD-18T-MSTN的基础上,成功地构建了重组表达质粒pET32a(+)-MSTN,将阳性重组质粒转化表达受体菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导表达后,表达产物利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行检测。结果,表达产物的蛋白分子量大小约为36.9KDa,与理论值相符。表达的蛋白经透析袋电洗脱法纯化后,分为未复性蛋白组和复性蛋白组,每组按50μg/只和150μg/只两个剂量分别免疫小鼠,共免疫三次。第三次免疫后10天开始对小鼠称重,以后每7天称重一次,共称重5次。结果复性高剂量组小鼠体重增长差值与其他各试验组及对照组之间差异显著,其他各试验组与对照组之间体重增加差值差异不显著,说明在本试验中牛MSTN重组蛋白有促进小鼠体重增长的作用。