猕猴桃抗溃疡病基因的生物信息学分析

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猕猴桃病害严重影响了猕猴桃的品质与产量,其中由丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种P. Syringae pv. actinidae(PSA)引起的猕猴桃细菌性溃疡病是最重要的病害之一。本研究从猕猴桃的抗病基因入手,分析植物抗病基因的序列结构与其功能的关系,找到能辅助猕猴桃抗溃疡病植株分子育种的标记,结果如下:1.以核苷酸结合位点(Nucleotide binding site, NBS)类基因保守序列,对‘红阳’猕猴桃全基因组中所有96条NBS-LRR类基因,利用Kiwifruit Genome Database、P fam和Coils Server网站,和Bioedit、MEGA 5.0、ClustalW软件,分析确定‘红阳’猕猴桃的NBS-LRR基因类型、结构和系统发育学关系。在‘红阳’猕猴桃全基因组中共有96个NBS-LRR类基因,其中27条NBS-LRR类基因分布在基因簇内,可根据其结构进一步划分为20类基因。并对NBS-LRR类基因家族进行了氨基酸多序列比对和系统进化树分析,发现整个NBS-LRR基因家族可分为三个亚家族。相对其它物种,红阳猕猴桃NBS-LRR类基因总数少,缺少TIR结构,具有LRR结构的基因所占比重低,NBS结构不完整,这些特点可能与其感病性有关联。2.以易感猕猴桃溃疡病品种‘红阳’猕猴桃全基因组中所有数据为基础,寻找到有可能存在猕猴桃抗溃疡病基因的两个抗病基因家族Pto-like基因家族和NBS-LRR基因家族的基因序列,并基于该序列设计引物,以溃疡病抗病品种‘徐香’猕猴桃的全基因组DNA为模板进行PCR扩增,克隆并测序最终得到41条能够通读的不重复序列序列,分析其结构特点并与‘红阳’猕猴桃的NBS-LRR基因序列结构进行对比分析,发现两个品种的NBS-LRR基因中几乎都没有Tir结构域,且NBS结构域结构特点有一定差异:在构成NBS结构的8个结构域中,相比‘红阳’猕猴桃,‘徐香’猕猴桃的NBS-LRR序列都具有更完整的Kinase2结构域,但是缺失RNBS-D结构和MHDVmotif结构比较严重;总体上来说,‘徐香’猕猴桃的NBS结构域更为完整。3.在‘红阳’猕猴桃全基因组序列中国搜集整理得到NBS家族(共96条)和RLK家族(共261条)两大抗病基因家族的序列,应用利用GRAMENE网站在线工具分析其结构,找到68对SSR位点,以此设计和筛选出最终产物在110-340bp,引物长度为18-22bp的引物,以17个品种猕猴桃全基因组DNA为模板扩增,最终筛选得到的两对引物基本能够在17个猕猴桃品种中表现出良好的扩增效果并表现出与溃疡病抗性有一定的相关性。
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