研究背景和目的肝细胞癌(HCC)是消化系统常见恶性肿瘤,其特征性在于高耐药性和缺乏根治性治疗方法。大部分病人就诊时已发生了转移,手术难以彻底清除体内癌灶,加之HCC早期诊断困难,值得研究新的细胞毒性药物和针对特定分子靶标的物质[1]。单壁碳纳米角(SWNHs),是一种不含任何金属催化剂的新型纳米碳,由于其独特的形态和结构受到越来越多关注[2]。现已证明,SWNHs能抑制人肝脏正常细胞和癌细胞生长、增殖和有丝分裂,推动细胞凋亡[3]。然而,其上游分子机制和对亚细胞结构影响缺乏进一步的探索。实验内容1.研究人体肝硬化向肝癌转变过程中线粒体内凋亡通路相关蛋白发生的相应变化。2.探讨SWNHs对体外HepG2细胞、L02细胞线粒体膜电位、Na+-K+-ATP酶活力、线粒体凋亡通路相关蛋白的影响。3.探讨SWNHs对裸鼠以及活体内HepG2细胞线粒体凋亡通路相关蛋白的影响。实验方法1.收集肝癌患者肝癌、癌旁以及肝硬化组织标本,免疫组化法检测线粒体凋亡相关蛋白的表达情况。2.使用不同浓度的SWHNs处理HepG2和L02细胞,线粒体膜电位检测试剂盒检测SWNHs对细胞线粒体膜电位的影响;使用Na+-K+-ATP酶检测试剂盒检测SWNHs对HepG2细胞Na+-K+-ATP酶活力的影响;使用蛋白免疫印迹法检测SWNHs对HepG2细胞、L02细胞对线粒体凋亡相关蛋白表达的影响。3.构建HepG2细胞-裸鼠移植瘤模型,定期瘤内注射不同浓度SWNHs,观察瘤体体积、裸鼠体重以及营养变化情况。HE染色法观察瘤体内HepG2细胞形态变化,天狼星红染色观察癌结节内纤维蛋白分布,蛋白免疫印迹法检测线粒体凋亡相关蛋白表达水平的影响。免疫组化法进一步检测线粒体凋亡相关蛋白表达水平及细胞内定位。结果:1.肿瘤组织中SIRT3、CYT-C的阳性强度与癌旁或肝硬化之间的差异有统计学意义,且2种蛋白细胞核内表达量明显减少;AceCS2在肝癌组织中表达量呈现上升趋势。Bax、SCNN1a、VDAC1在肝硬化、癌旁以及癌组织之间的表达量、表达位置无明显差异。2.SWNHs能诱导HepG2细胞线粒体膜电位去极化,对L02细胞线粒体膜电位的影响非常小。Na+-K+-ATP酶检测提示SWNHs能抑制Na+-K+-ATP酶活力。蛋白印迹法实验结果提示,SWNHs上调SIRT3、VDAC1以及CYT-C的表达,下调AceCS2、Bax的表达,但对SCNN1a的影响不大,对L02细胞线粒体凋亡通路蛋白影响不大。3.与对照组相比,SWNHs对负瘤裸鼠体重、营养状态以及HepG2细胞移植瘤大体体积、细胞形态、凋亡小体数目、瘤结节间纤维组织分布均无明显差异。蛋白印迹法结果提示:SWNHs能上调HepG2移植瘤内SIRT3、Bax的表达,对VDAC1、AceCS2、CYT-C、SCNN1a影响不大。免疫组化结果提示:SWNHs能显著上调HepG2移植瘤内SIRT3、VDAC1、Bax的表达,显著下调AceCS2的表达,对CYT-C的影响差异不存在统计学差异。另外,经过SWNHs处理后,SIRT3、SCNN1a呈现细胞核、细胞浆共表达;AceCS2细胞浆表达量较少,但细胞核内表达量有增多趋势;而Bax、VDAC1、CYT-C表达位置变化不大。结论:肝硬化组织癌变过程中,线粒体凋亡通路蛋白灭活,凋亡蛋白在细胞核内表达量减少,细胞内线粒体能力代谢活跃。SWNHs能促使线粒体膜电位去极化,抑制ATP酶活性,线粒体功能障碍,促进线粒体凋亡通路蛋白(如SIRT3、CYT-C等)的过表达并释放到细胞质中,与细胞浆凋亡因子结合,诱导肝癌细胞发生凋亡。