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奶酪是原料奶用量最大的乳制品,凝乳酶作为奶酪生产过程中的关键用酶,其主要生物学功能是有限剪切牛乳中κ-酪蛋白的Phe105-Met106健,使牛奶发生凝结,被广泛用于奶酪生产中,成为重要的酶制剂,其需求量约占全世界酶制剂生产总量的15%,成为第二大酶制剂。目前,全世界应用最为广泛的凝乳酶提取自小牛皱胃(第四胃),自从人们开始加工干酪以来,就大量屠宰小牛以获得凝乳酶,而可供屠宰的小牛数量逐年减少,从而导致世界范围内凝乳酶供应相对缺乏,使凝乳酶价格不断上涨,迫使人们不得不寻找来源广泛、价格低廉的新型凝乳酶。微生物具有生产周期短、易培养等诸多优点,利用微生物凝乳酶成为目前最有前途的发展方向,开发潜力大,因此本研究旨在筛选出凝乳酶高产菌株,并对其进行系统研究,为凝乳酶的生产提供一定的理论基础。本研究主要结果如下：1从红曲米中筛选到一株具有良好凝乳活性凝乳酶产生菌株QY229,通过形态特征及ITS-rRNA基因序列鉴定,确定其为Q. cyanescens。0.02mM的特异性蛋白酶抑制剂Pepstatin A可使该菌发酵液失去凝乳活性,说明该菌所产凝乳酶为天冬氨酸类蛋白酶家族的一种。Shotgun(鸟枪法)蛋白鉴定结果中未见有与已报道的凝乳酶相关蛋白,说明Q. cyanescens产凝乳酶是一种新型蛋白。2通过DEAE Cellulose-52离子交换层析富集、Hiprep 16/10 DEAE FF阴离子交换柱层析和Superdex 75 10/300 GL凝胶过滤层析,从发酵液中纯化了凝乳酶蛋白,在SDS-PAGE电泳上显示单一条带,纯化倍数为24.1,回收率为19.1%。酶学性质研究表明,该酶最适宜反应温度40℃,在30～40℃范围内可以保持较好的稳定性,最适pH为5.0,pH4.5～6.5之间,能够保持稳定的活性,Ca2+、Mg2+、Zn2+和Fe2+对凝乳酶的凝乳活力有促进作用,其中Ca2+对凝乳酶的凝乳活力的促进作用最好,K+、Na+和Cu2+对凝乳活力有一定的抑制作用,Q. cyanescens凝乳酶和小牛皱胃酶对乳酪蛋白的水解能力没有显著差异。3通过镜下连续观察培养确定了制备Q. cyanescens单孢子悬浮液的时间为6天,研究了不同剂量的紫外线与硫酸二乙酯对Q. cyanescens的致死率,绘制了致死率曲线,确定了紫外诱变Q. cyanescens单孢子悬浮液的时间为240S,硫酸二乙酯诱变Q.cyanescens单孢子悬浮液孢子的时间为40min。在此基础上,以Q. cyanescens单孢子悬浮液为诱变对象,进行了UV、DES单因子诱变及先UV后DES、先DES后UV复合因子诱变,选育到一株凝乳酶产量较诱变初发菌株高105.16%的诱变菌株DUl0。遗传稳定性试验表明,该菌株表现出稳定的遗传性能。4对DU10菌株发酵的培养基及培养条件进行优化研究。在单因素试验基础上,基于Plackett-Burman设计对培养基成分和起始pH、培养温度、接种量、摇床转速、培养时间等12个影响产酶的相关因子进行了筛选,结果表明在PB设计的二水平范围内,葡萄糖浓度和摇床转速与酶活性呈正效应(p<0.05),起始pH对酶活性呈显著的负效应(p<0.05),其它相关因素影响不显著(p>0.05)。然后,基于Box-Behnken设计的响应曲面优化法对主要影响产酶因子的最佳水平及其交互作用进行了进一步研究,并建立了二次多项数学预测模型,确定了菌株Q. cyanescens DU10产生凝乳酶的最佳发酵条件为：葡萄糖36g/L,蛋白胨4g/L,酵母膏5g/L,氯化钙0.5g/L硫酸锰2.0mg/L,吐温-80 0.8g/L,起始pH 4.6,装液量50mL/250mL摇瓶,接种量1%(V/V),培养温度30℃,摇床转速188r/min,发酵时间96h。在优化的发酵条件下,菌株Q.cyanescens DU 10产凝乳酶活性增加了2.5倍,凝乳活性达6.10IMCU/mL.5将Q. cyanescens产凝乳酶在奶酪生产进行了应用研究。在单因素试验的基础上进行了正交试验,获得了Q. cyanescens产凝乳酶加工奶酪的工艺参数组合为：凝乳酶添加量50 IMCU/L、CaCl2添加量0.02%、保温时间40min、凝乳温度35℃。利用TA-XT.PLUS/30食品物性测试仪对用凝乳酶制作的奶酪进行TPA质地剖面分析,结果表明Q. cyanescens凝乳酶生产的奶酪和小牛皱胃酶生产的奶酪在质构参数上没有显著差异；利用CVOR150流变仪对加入凝乳酶牛乳的动态流变学参数进行了表征,表明Q. cyanescens凝乳酶和小牛皱胃酶作用于牛乳的动态流变参数没有显著差异。