【摘 要】
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目的:1.观察在电场条件下骨髓间充质干细胞是否能实现定向迁移及定向分化,同时观察电场作用对耳蜗毛细胞的生存与调亡是否有影响。2.探索电场培养的条件,观察细胞迁移以及生长的状态。方法:1.全骨髓直接贴壁法分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymals-temcells,BMSCs),检测 BMSCs 表面标志 CD44,CD90 及造血细胞表面抗原CD45和CD3
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目的:1.观察在电场条件下骨髓间充质干细胞是否能实现定向迁移及定向分化,同时观察电场作用对耳蜗毛细胞的生存与调亡是否有影响。2.探索电场培养的条件,观察细胞迁移以及生长的状态。方法:1.全骨髓直接贴壁法分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymals-temcells,BMSCs),检测 BMSCs 表面标志 CD44,CD90 及造血细胞表面抗原CD45和CD34的表达情况。绿色荧光蛋白(GFP)转染到BMSCs,倒置荧光显微镜下观察BMSCs中的GFP表达情况及GFP阳性率。2.耳毒鼠模型:采用新生的SD大鼠,1:100ul新霉素干预基底膜10小时,通过Myosin Vlla免疫荧光观察毛细胞是否损伤及损伤情况。3.电场制备及电场迁移实验(电场对骨髓间充质干细胞活力的影响):实验分组:共分4组,对照组(A):未暴露电场;实验组B:暴露电场半小时;实验组C:暴露电场1小时;实验组D:暴露电场2h。4.骨髓间充质干细胞的分化与鉴定:未经电场作用的基底膜与GFP转染后的骨髓间充质干细胞与电场作用后的基底膜分别在培养液中培养14天,免疫组化鉴定骨髓间充质干细胞是否分化为毛细胞并表达Myosin7A、Math1。结果:1.全骨髓培养法下获得的骨髓间充质干细胞经流式细胞仪检测CD90、CD44分别表达为:99.7%,99.1%;CD45、CD34 表达为:4.1%,2.11%,细胞免疫荧光验证与流式仪结果相符。结合细胞形态分析,符合BMSCs的特征。2.将含GFP的BMSCs与损伤处理后的基底膜共同至于电场环境中,实时荧光显微镜下BMSCs细胞向基底膜迁移,大部分迁移至基底膜的BMSCs位于底圈,少数可见于中圈,顶圈处未见明显BMSCs迁移。共培养14天后行免疫细胞化学鉴定分化细胞表达毛细胞的特异性标志物Myosin7A、Math1。结论:骨髓间充质干细胞可以在电场环境下可以实现向损伤处定向迁移并分化为具有内耳毛细胞分子特征的毛细胞样细胞。适当的电场环境为治疗耳聋提供了一种新的治疗途径。
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