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背景肾小球血管上皮细胞(足细胞)是终末分化的细胞,大量的足突是足细胞的标志。两个相邻足细胞足突之间形成的裂隙膜是血浆蛋白滤出的关键分子屏障。足细胞数量减少,足突融合或裂隙膜蛋白表达减少都是大量蛋白尿发生的细胞分子学基础。因此,足细胞受损后足细胞凋亡与坏死是肾小球疾病启动和进展的关键因素。我们前期的体外研究显示激活足细胞代谢型谷氨酸受体(metabotropic glutamate receptor,mGluR)1/5后,可以通过环磷酸腺苷(cyclic AMP,cAMP)信号依赖的方式防止氨基核苷嘌呤霉素(puromycin aminonucleoside,PAN)诱导的足细胞凋亡。进一步研究发现蛋白激酶A(PKA)信号介导了cAMP保护足细胞的作用,但是还不清楚激活PKA信号后下游信号保护足细胞的具体机制。经典的PKA信号通过其下游的转录因子cAMP反应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)调节靶基因转录发挥其生物学作用。另外我们以前的工作发现PKA信号通过防止线粒体分裂从而保护足细胞,线粒体的主要功能是通过氧化磷酸化为组织细胞提供能量,PKA信号是否影响足细胞线粒体氧化磷酸化和三磷酸腺苷(ATP)产生也不清楚。目的探讨转录因子CREB在c AMP/PKA信号保护足细胞中的作用,以及对细胞内线粒体氧化磷酸化的影响。方法我们使用条件永恒的小鼠足细胞株5P12,15-25代分化的足细胞进行研究。Cell Counting Kit-8方法检测细胞毒性,Annexin V/PI染色与流式细胞术检测足细胞凋亡,免疫荧光检测p-CREB的表达。RNA干扰技术抑制足细胞内CREB表达,应用Agilent表达谱芯片检测小鼠足细胞全基因组mRNA的表达情况。Real-time PCR检测线粒体基因编码的呼吸链复合体基因的表达。荧光素酶化学发光检测足细胞内ATP的水平。Western blot检测蛋白质表达。结果PKA特异性激动剂pCPT-cAMP分别刺激5min、15min可使足细胞总蛋白中磷酸化CREB(p-CREB)表达上升105.64±38.21%,98.61±41.03%(p<0.05),细胞核内p-CREB的表达上升114.52±11.28%,118.84±14.44%,p<0.05。免疫荧光共聚焦显微镜显示pCPT-cAMP主要引起细胞核内p-CREB表达上升。我们发现阿霉素(ADR)可以诱导足细胞凋亡,pCPT-cAMP预孵育足细胞可以防止ADR诱导的足细胞内被切割的半胱氨酸蛋白酶-3(cleaved caspase-3)表达升高和足细胞的数量减少。RNA干扰(RNAi)可使得足细胞CREB蛋白表达下降为原来的25.1±2.44%。抑制CREB表达后pCPT-cAMP失去了保护的作用。应用Agilent表达谱芯片检测小鼠足细胞全基因组表达发现,ADR刺激可使足细胞内线粒体基因编码的呼吸链复合体I各亚基基因表达明显下调,pCPT-cAMP预孵育可以防止ADR诱导的足细胞内线粒体编码的呼吸链复合体I的ND1-5亚基的mRNA表达下调。Western blot实验证实激活cAMP/PKA可防止ADR引起的足细胞线粒体呼吸链复合体I亚基ND1/3/4蛋白的表达下降,而其他亚基蛋白的表达无明显差异。pCPT-cAMP预处理可以防止ND3,而非ND1/4蛋白的降低,这种作用在抑制足细胞内CREB蛋白表达之后消失。同时,CREB siRNA也可减弱pCPT-cAMP引起的足细胞ATP产生增加以及过氧化物酶体增殖活化受体γ共激活因子-1α(PGC-1α)的表达上升。结论cAMP/PKA信号可能通过下游CREB转录因子防止ADR诱导的足细胞损伤,至少部分是由于增加线粒体呼吸链蛋白表达和ATP产生。