苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)被广泛的应用于农业、园艺、森林、储藏类害虫的防治。目前越来越多的Bt生物杀虫剂和转Bt作物被广泛的开发和应用,在有害昆虫的防治过程中取得了良好的防治效果。目前,世界许多国家都在研究延缓昆虫抗性产生的有效办法,其首要工作是分离并挖掘新的具有广谱杀虫性的Bt杀虫晶体蛋白。另外长期单一的使用一种杀虫毒素,使得有害昆虫的抗性逐渐产生,次要害虫也逐渐变成主要害虫,对害虫的防治造成了很大的困扰。本研究对云南地区不同生态地区进行Bt资源的分离,并鉴定基因型和分析生物活性,并选择了五个菌株来研究其对玉米螟、甜菜夜蛾、棉铃虫三种鳞翅目害虫的生长发育的影响。具体结论如下:1、菌株的分离鉴定、基因型分析和生物测定:本次研究从云南不同生态区共采集土样1487份,得到菌株1741株,利用光学显微镜从中鉴定出406株Bt菌,平均分离率达到20%以上。利用PCR-RFLP法来鉴定此次分离出的Bt菌株,发现了 18 种基因型,分别是 cry1、cry2、cry11、cry4、cry6、cry7、cry9、cry15、cry20、cry26、cry28、cry30、cry40、cry54、cry56、cry73、cyt2 和 vip3,其中 cry1和cry2基因型最多,达到了 65%以上;其次是cry4、cry28、cry30的基因型相对含量较多,而cry9类基因型相对偏少。通过对这些基因型的鉴定,我们还发现杀鳞翅目害虫的基因型(cry1A、cry2A)偏多,杀双翅目害虫的基因型(cry4B、cry20A)偏少,还有部分杀线虫(cry6A)和鞘翅目(cry7A)的基因型。选择部分有代表性的菌株进行SDS-PAGE蛋白电泳分析,发现这些菌株主要表达条带大小为130kDa、90kDa、75kDa、66kDa、55kDa、35kDa、30kDa 和 15kDa。这也表明分离到的Bt菌株基因类型极为丰富。此外我们还对这些菌株进行生物活性测定,发现这些菌株具有较广的杀虫活性,对鳞翅目害虫有良好的作用效果。2、玉米螟取食含Bt菌蛋白的半人工饲料对其生长发育的影响:本研究从菌株中选择了对玉米螟具有阻碍生长作用的LJ76-2、LJ86-1、DL80-1、KM54-1和DQ62-1五株产生球状晶体的菌株进一步研究。采用PCR-RFLP和SDS-PAGE分析鉴定发现这些菌株具有多种基因型且表达多种蛋白条带,表明可能含有新的基因型。我们用含不同Bt菌蛋白的半人工饲料对玉米螟幼虫喂食,结果发现:这五个菌株蛋白对玉米螟的生长发育具有不同程度的阻碍作用,主要表现为幼虫的平均体长变短、平均存活率较低、化蛹个数偏少、虫态历期增长等方面,但能够成功化蛹的玉米螟大多数都能成功羽化。因此本研究通过对玉米螟幼虫分别喂食含不同Bt菌蛋白的半人工饲料证实了这几株Bt菌对玉米螟的生长发育在不同程度上有一定的阻碍作用。3、甜菜夜蛾取食含Bt菌蛋白的半人工饲料对其生长发育的影响:本研究将制好的含菌半人工饲料用来喂食甜菜夜蛾幼虫并观察其生长发育情况,分析数据表明,这几种菌对甜菜夜蛾的作用效果同对照组相比有不同的差异性。DQ62-1这个菌株对甜菜夜蛾的作用效果初始与对照组差异不大,后期逐步出现差异性,发育完整性也较其他组晚;对甜菜夜蛾作用效果最好的是LJ76-2和DL80-1这两组,第七天时无论是平均虫体长度还是存活率都要明显的差别于对照组,并且还与其他组的作用效果有所差异,此外,这两组的化蛹率也最低。因此,通过这一系列的实验结果发现,LJ76-2和DL80-1这两株菌具有较好的实际应用价值。4、棉铃虫取食含Bt菌蛋白的半人工饲料对其生长发育的影响:本实验还研究了含不同Bt菌蛋白的半人工饲料对棉铃虫幼虫的生长发育情况,发现棉铃虫在不同的生长发育时间其平均存活率是逐步降低的,在半人工饲料中添加的不同的苏云金芽胞杆菌蛋白均使棉铃虫的生长发育受到影响。通过显著性分析情况来看,各个实验组除了 LJ86-1与其他实验组有差异外,其余实验组之间的差异性都不明显。在观察幼虫生长发育时我们还发现初始时期棉铃虫幼虫出现拒食现象,幼虫体长变化不明显,部分幼虫在适应Bt毒素的作用效果后,通过调节自身的生理代谢机制,继续进行生长发育,部分未能成功调节的幼虫则逐步死亡。综上所述,云南地区不仅具有丰富的Bt资源,且有多种多样的类型。因此开展Bt菌株的深入挖掘工作具有重要的意义。通过研究我们选择的五个菌株对鳞翅目害虫的生长发育的作用研究,其结果可以用于Bt蛋白对有害昆虫作用的参考,还可为有害昆虫的防治和转基因作物的生物效果研究提供新的数据支持。