论文部分内容阅读
目的:真菌性角膜炎是角膜溃疡的主要病因,可导致严重的视力损害和失明。虾青素(Astaxanthin,ASX)是一种脂溶性酮类胡萝卜素,已被证明能抑制多种疾病的免疫炎症反应。本研究旨在探讨ASX对烟曲霉性角膜炎小鼠模型的作用及其具体作用机制。方法:为了探究ASX对于烟曲霉菌诱导的角膜炎的作用,进行了体内及体外实验。体内实验部分,准备8周C57BL/6小鼠,通过腹腔注射8%水合氯醛(0.4ml/kg)麻醉。在立体显微镜下,用角膜基质注射针将烟曲霉菌孢子悬浮液注射于右眼角膜基质中。将小鼠平均随机分为ASX处理组以及DMSO处理组,并用对应试剂溶液滴眼处理(3次/天),在不同时间点麻醉小鼠后在裂隙灯下拍摄小鼠角膜照片并根据角膜的炎症程度记录临床评分。在不同时间点麻醉小鼠后通过颈椎脱臼法处死小鼠,根据Real-Time RT-PCR法、Western Blot法和ELISA法检测炎性细胞因子(TNF-α、IL-1β、HMGB1)以及模式识别受体TLR2、TLR4的表达水平,并用免疫荧光法检测角膜中性粒细胞、巨噬细胞及TLR2、TLR4的表达。体外细胞系实验部分,根据处理条件分为6组,分别为正常组、DMSO组、ASX处理组、烟曲霉菌组、烟曲霉菌+DMSO组和烟曲霉菌+ASX组,Raw264.7细胞生长均匀并达到约80%融合时,换液后,在上述对应的分组中加入相同浓度的DMSO及ASX预处理2小时后,在对应的分组中加入灭活的烟曲霉菌菌丝悬浮液,菌丝终浓度为5×106 cfu/ml,刺激8小时后收取十二孔板的Raw264.7细胞,用于RealTime RT-PCR法检测下游促炎细胞因子(IL-1β、TNF-α、HMGB-1)以及模式识别受体TLR2、TLR4的表达。结果:1.烟曲霉菌感染小鼠角膜后第3天,ASX治疗组的角膜溃疡面及明显缩小、炎症反应明显下降、病理变化程度显著降低,且感染后第1、3、5天的临床炎症评分ASX处理组均低于DMSO组,并且MPO活力在感染后第3天时ASX治疗组较DMSO组显著降低。2.免疫荧光显示,与DMSO处理组相比,ASX治疗组小鼠在感染后3天中性粒细胞数量及巨噬细胞显著减少。烟曲霉菌诱导的真菌性角膜炎小鼠角膜模型中,第1、3、5天,ASX处理组的IL-1β、TNF-α及HMGB1的mRNA表达水平均显著低于DMSO处理组。此外,ELISA结果显示建模后第3天时ASX处理组中IL-1β、TNF-α和HMGB-1的蛋白表达水平较DMSO处理组降低。在体外实验中ASX预处理的细胞与DMSO处理组相比,IL-1β、TNF-α和HMGB-1的mRNA表达降低。3.在建模后第1、3、5天取小鼠角膜测定其相对mRNA水平,结果示,与DMSO处理组相比,ASX处理组TLR2、TLR4的相对mRNA水平显著降低。Western Blot结果显示,烟曲霉感染后TLR2、TLR4的表达水平上调,而ASX处理组在第3天和第5天显著抑制了这种上调。免疫荧光结果显示,与DMSO处理组相比,ASX治疗组小鼠角膜在感染后3天TLR2、TLR4的表达显著减少。在体外实验中ASX预处理的细胞与DMSO处理组相比,TLR4的mRNA表达显著降低。结论:ASX能够有效减轻烟曲霉菌诱导的真菌性角膜炎的疾病严重程度表现,减轻临床炎症评分。ASX不仅减少了烟曲霉菌诱导的真菌性角膜炎病程中中性粒细胞及巨噬细胞的募集及浸润,而且显著的减少了多种炎症因子(TNF-α、IL-1β和HMGB-1)的表达,减轻炎症反应。而且ASX的抗炎作用与模式识别受体TLR2、TLR4有密切关系。ASX的使用可以作为真菌性角膜炎的一种潜在治疗方案。