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目的:通过实验了解天然麝香对神经干细胞存活、增殖、分化、凋亡的影响,为天然麝香在缺血性脑血管病中的应用提供理论基础,并为神经干细胞的临床应用提供试验依据。
方法:从新生大鼠海马组织分离出神经干细胞,进行神经干细胞原代培养、传代培养、免疫组织化学法和荧光法做nestin染色鉴定,传代三次后进行分组实验。实验分组:(1)无血清培养组(A组);(2)无血清培养加天然麝香组(B组);(3)缺氧无血清培养组(C组);(4)缺氧无血清培养加天然麝香组(D组)。NSCs以1×105个/mL在上述四组培养基中分别培养。每3-5d换半液,7d换全液。在1d,3d,6d,12d通过nestin染色的神经干细胞以计数方法来观察各时间点神经干细胞的存活和增殖;通过免疫组化计数各时间点的MAP-2、GFAP、GC阳性细胞数来观察神经干细胞向神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的分化情况;以各时间点Caspase免疫荧光阳性细胞来观察神经干细胞的凋亡情况。SPSS统计学处理。
结果:
NSCs形态学观察及鉴定:.原代分离的单细胞3d增生为神经细胞球,传代后,经nestin免疫荧光染色,细胞球呈阳性。A组和B组比较观察:随着培养天数的增加,B组细胞数明显多于A组,且细胞团大,细胞折光性强,并有少量细胞贴壁,有突起形成;后期细胞突起较长,较早形成网格,且密集。B组nestin阳性细胞数高于A组(P<0.05),且在中期nestin阳性细胞数更加明显(P<0.01),后期B组nestin阳性细胞数高于A组(P<0.05);中期B组MAP-2阳性细胞数高于A组(P<0.05),GFAP、GC阳性细胞数两组未见差异(P>0.05);后期A组MAP-2阳性细胞数高于B组(P<0.05),GFAP、GC阳性细胞数B组明显高于A组(P<0.01)。Caspase免疫荧光阳性细胞数在各个时间点A组均高于B组(P<0.05)。
C组和D组比较观察:随着培养天数的增加,D组细胞数多于C组,且C组细胞折光性差,出现很多细胞碎屑,D组出现细胞分化贴壁,突起形成。早期D组nestin阳性细胞数高C组(P<0.05),后期nestin阳性细胞数更加明显(P<0.01);早期两组均未见MAP-2、GFAP、GC阳性细胞,中期D组MAP-2阳性细胞数高于C组(P<0.05),GFAP、GC阳性细胞数两组未见差异(P>0.05),后期D组MAP-2阳性细胞数高于C组(P<0.05),GFAP、GC阳性细胞数D组明显高于C组(P<0.01)。Caspase荧光阳性细胞数在各个时间点C组均明显高于D组(P<0.01)。
结论:
1.天然麝香可以促进体外培养的神经干细胞的增殖,分化。
2,在缺氧情况下,天然麝香对神经干细胞具有保护作用,增加其存活,减少其凋亡。促进神经干细胞分化。