小干扰RNA抑制肝癌细胞胰岛素样生长因子Ⅱ基因表达的初步研究

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目的:设计靶向IGF-Ⅱ基因的siRNA,观察其对肝癌细胞株SMMC-7721生长的影响及IGF-Ⅱ表达的抑制作用;明确有效抑制肝癌细胞人胰岛素样生长因子Ⅱ基因mRNA表达的siRNA序列及其作用浓度,为肝癌的基因治疗提供依据。 方法:本实验靶向IGF-Ⅱ mRNA不同位点设计的3条siRNA序列转入肝癌细胞株SMMC-7721,并行FAM荧光标记,同时设立一个无任何靶基因的siRNA作为阴性对照(siRNA4)。通过脂质体将合成的siRNA1~3分别转入SMMC-7721肝癌细胞株,以siRNA4、未转染细胞及转染空脂质体细胞为对照。荧光显微镜下观察siRNA的转染效率;MTF法检测siRNA对细胞生长的抑制;用RT-PCR检测siRNA对IGF-Ⅱ mRNA表达的抑制作用。 结果:利用FAM荧光标记观察到siRNA转染效率可达65~80%。实验组siRNA1、2、3与对照组、脂质体组和siRNA4的MTF值以及细胞存活率在各时点均有显著性差异(P<0.01),随着时间延长抑制效果增强,以siRNA3效果最为显著。将siRNA3用于进行下一步浓度效应实验,观察四个转染终浓度:10、20、40、80nM的siRNA3对基因的作用。半定量RT-PCR结果表明,当siRNA浓度达到10nM时就可降解mRNA,随着浓度增加抑制效果增强,在40nM时作用最强,可达86.34%。将40nM siRNA1~3分别转染细胞,均有不同程度抑制作用,其中siRNA3抑制率最高,与生长抑制实验结果一致,因此筛选出最有效siRNA序列为siRNA3,其序列为正义链:5′-GUUCUUCCAAUAUGACACC-3′,反义链:5′-GGUGUCAUAUUGGAAGAAC-3′。 结论:设计合成靶向IGF-ⅡmRNA序列的siRNA,采用化学合成及脂质体转染肝癌细胞株SMMC-7721,有较高的转染效率,筛选出一条siRNA并明确其最佳有效浓度,这条siRNA能有效抑制肝癌细胞生长及IGF-ⅡmRNA的表达。在肝癌的基因治疗中,IGF-Ⅱ是有效靶点,有利于进一步明确该方法用于肝癌的基因治疗。
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