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Wnt拮抗剂SFliP1在胃肠道肿瘤发病机制中的作用前言Wnt信号通路参与了成体组织细胞的增殖、分化及凋亡过程。因此异常的Wnt信号转导过程常导致肿瘤生成。近年来，Wnt信号通路上游成分出现异常参与肿瘤发病逐渐被发现。Wnt1、Wnt2、Wnt3a等Wnt家族成员过度表达均被发现可诱导肿瘤生成。此外，Wnt拮抗剂表达下调所致Wnt信号通路过度激活亦常诱导肿瘤发生。例如Dkk家族表达下调参与了部分肿瘤的发病过程。最近，分泌型frizzled相关蛋白1 (SFRP1)表达沉默在肿瘤中被发现。胃肠道肿瘤是人类最常见的恶性肿瘤之一，探讨其发病的分子机制，找到有效的早期诊断及治疗方法成为一个十分迫切的问题。大量的研究显示胃肠道肿瘤的发病是一个多基因参与的过程，其中包括抑癌基因突变及原癌基因激活等。此外，遗传表型改变在胃肠道肿瘤发病机制中的作用也日益受到重视。本文对SFRP1在胃肠道肿瘤中的表达情况及其机制进行研究，以探讨SFRP1表达改变在胃肠道肿瘤发病机制中的作用。有证据显示Wnt过度表达常引起肿瘤侵袭转移能力增强。由于SFRP1表达下调导致Wnt通路过度激活已被证实参与了人类部分肿瘤的发生，因此SFRP1表达下调与胃肠道肿瘤转移侵袭能力之间的相关性成为我们继续要研究的问题。影响胃肠道肿瘤转移的因素众多，基质金属蛋白酶(MMPs)过度表达或激活是其中一个重要机制。基质金属蛋白酶家族成员中的MMP-9和MMP-2能有效的分解基底膜的主要成分Ⅳ型胶原蛋白，两者的过度表达常引起胃肠道肿瘤的转移侵袭能力增强。本文将进一步探讨SFRP1表达下调与胃肠道肿瘤转移侵袭能力之间的相关性。通过检测MMP-2和MMP-9水平，探讨其具体机制。材料与方法1、材料胃癌及相应的癌旁组织各52例，结直肠癌及相应的癌旁组织各60例，均来自于中国医科大学附属第二医院。标本获取后即冷冻于液氮之中。人类胃癌细胞系SGC-7901，BGC-823和HGC-27，结肠癌细胞系HT-29和SW-480均购自上海昆肯生物化工有限公司。Trizol试剂、RNA PCR试剂盒和LightCycler DNA MasterSYBR Green I试剂盒，购自于宝生物公司。GENMED基因甲基化检测试剂盒购自于上海杰美公司。SFRP1、MMP-2和MMP-9多克隆抗体购自于美国SANTACRUZ公司。2、方法人类胃癌细胞系SGC-7901、BGC-823、HGC-27，结肠癌细胞系HT-29和SW-480均培养于RPMI 1640中，添加10％肽牛血清，青霉素(100IU／ml)及链霉素(100／μg／ml)。采用饱和氯化钠法进行DNA提取。采用Trizol法进行RNA提取。采用逆转录PCR (RT-PCR)进行SFRP1 mRNA定性检测。采用即时定量PCR检测MMP-2和MMP-9mRNA表达。采用甲基化特异性PCR (MSP)检测SFRP1基因甲基化状态。采用Western blotting检测MMP-2和MMP-9蛋白表达。3、统计学分析肿瘤组织与癌旁组织比较采用卡方检验；肿瘤细胞之间的比较采用t检验；SFRP1表达与患者临床病理特征之间的相关性分析采用Fisher’s精确检验。P＜0.05为有统计学意义。结果1、胃癌细胞系SFRP1甲基化状态及表达状态胃癌细胞BGC-823和HGC-27存在SFRP1基因甲基化，而SGC-7901未检出SFRP1基因甲基化。SGC-7901存在SFRP1 mRNA表达，而BGC-823和HGC-27未检出表达。采用去甲基化试剂5—氮杂—脱氧胞苷酸(5-aza-2’-deoxycytidine)对BGC-823和HGC-27进行处理后，SFRP1 mRNA重新出现表达。2、胃癌标本及癌旁组织中SFRP1甲基化状态及表达状态在52例胃癌中，23例存在SFRP1基因甲基化现象。在其相应的癌旁组织中，8例检出SFRP1甲基化，两者差异显著(P＜0.01)。17例胃癌存在SFRP1表达消失。在其相应的癌旁组织中，6例表达消失，两者差异显著(P＜0.01)。SFRP1表达消失与SFRP1基因甲基化具有显著相关性(P＜0.001)。3、结肠癌细胞系SFRP1甲基化状态及表达状态结肠癌细胞SW-480检出SFRP1基因甲基化，而HT-29未检出SFRP1基因甲基化。HT-29存在SFRP1 mRNA表达，而SW-480未检出表达。采用去甲基化试剂5—氮杂—脱氧胞苷酸对SW-480进行处理后，SFRP1 mRNA重新出现表达。4、结肠癌标本及癌旁组织中SFRP1甲基化状态及表达状态在60例结直肠癌中，38例存在SFRP1基因甲基化现象。在其相应的癌旁组织中，11例检出SFRP1甲基化，两者差异显著(P＜0.01)。35例结直肠癌存在SFRP1表达消失。在其相应的癌旁组织中，8例表达消失，两者差异显著(P＜0.01)。SFRP1表达消失与SFRP1基因甲基化具有显著相关性(P＜0.001)。5、SFRP1表达消失与胃癌、结肠癌患者临床病理特征之间的相关性SFRP1表达消失与胃癌患者年龄、性别、肿瘤大小及组织类型均无相关性，而与肿瘤分期、淋巴结转移情况具有相关性。SFRP1表达消失与结直肠患者年龄、性别、肿瘤大小均无相关性，而与肿瘤分期、淋巴结转移情况具有相关性。6、胃癌和结肠癌细胞系MMP-2和MMP-9 mRNA表达在胃癌细胞系中，SGC-7901表达低水平MMP-2和MMP-9 mRNA，而BGC-823表达高水平MMP-2和MMP-9 mRNA，两者差异显著(P＜0.01))。在结肠癌细胞系中，HT-29表达低水平的MMP-2和MMP-9 mRNA，而SW-480表达高水平MMP-2和MMP-9 mRNA，两者差异显著(P＜0.01))。7、胃癌和结肠癌细胞系MMP-2和MMP-9蛋白表达在胃癌细胞系中，SGC-7901表达低水平MMP-2和MMP-9蛋白，而BGC-27表达高水平的MMP-2和MMP-9蛋白。结肠癌细胞系中HT-29表达低水平MMP-2和MMP-9蛋白，而SW-480表达高水平的MMP-2和MMP-9蛋白。8、胃癌和结肠癌细胞系经去甲基化处理后检测采用去甲基化试剂5—氮杂—脱氧胞苷酸处理胃癌细胞系BGC-27和结肠癌细胞系SW480后，发现MMP-2和MMP-9 mRNA水平均较处理前显著降低(P＜0.01)．结论(1) SFRP1在部分胃癌中表达消失，其机制主要由SFRP1基因甲基化所致。结果提示，SFRP1表达消失与部分胃癌发病有关。(2) SFRP1在部分结直肠癌中表达消失，且其机制主要由SFRP1基因甲基化所致。结果提示，SFRP1表达消失与部分结直肠癌发病有关。(3) SFRP1表达消失可增加胃癌及结直肠癌转移侵袭能力。(4) SFRP1表达消失可上调MMP-2和MMP-9的表达。SFRP1表达消失促进胃癌侵袭转移可能是通过上调MMP-2和MMP-9表达而实现。