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该实验以自然存在的核桃早实类群和晚实类群为试材,利用RAPD技术,参照BSA法,寻找获得与核桃早实性状相关的RAPD分子标记,并进一步将该RAPD标记转化为特异性的SCAR标记.该研究的主要内容包括:1.采用CTAB法和改进的CTAB法,从叶片中提取核桃基因组DNA,比较其分离效果.结果表明,常规的CTAB法不能有效去除多糖和多酚,而改进CTAB法不论老叶新叶都能有效去除细胞内多糖和多酚等杂质对模板DNA的污染,获得的DNA纯度高,可进一步用于核桃分子生物学的操作.2.着重对影响RAPD-PCR可重复的主要因子和参数进行优化研究,即对Taq DNA聚合酶、Mg<2+>、模板DNA的浓度以及PCR扩增中的变性时间、复性温度、循环数等设置不同的剃度进行实验.结果表明,Taq DNA聚合酶为1.5U、Mg<2+>为2.5mmol/L、模板DNA为40ng;变性时间为60s、复性温度为38℃、循环数为45时扩增效果理想,重复性好.建立了适于核桃分子标记的RAPD-PCR反应体系,为该树种进一步的分子生物学研究奠定基础.3.参照分群法(BSA)法建立了早实核桃类群和晚实核桃类群的近等基因池(DNA-pool).从美国Operon公司生产的9组(A、B、C、D、E、G、P、T、W)共180个随机引物中选出了5个多态性引物,共扩增出约1600条DNA带,进一步用这5个引物进行单株验证,发现只有引物OPGl5(5-ACTGGGACTC-3)在早实核桃的8个类型中能重复扩增出一条759bp的特异带,而晚实核桃的8个类型中无此特异带.将此特异片段回收、纯化,克隆到pUCm-T载体后进行蓝白斑重组子筛选并酶切鉴定,阳性克隆用于测序.结果表明该片段的准确大小为759bp.4.对测定序列进行genebank在线分析,发现该标记在国内外尚未见报道.然后根据该序列设计一对特异性引物P1和P2,将该多态性RAPD_OPGl5<,759>标记成功地转化为特异性的SCAR标记.初步认为,OPGl5<,759>可能是与核桃早实性状相关的分子标记,该标记需进一步加以确定.以下是用于SCAR标记的引物序列:Sense primer(P1):5-ACTGGGACTCCAATTGTATC-3Anti-sense primer(P2):5-ACTGGGACTCTCAACTAT-3