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研究背景:鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是我国高发恶性肿瘤之一,肿瘤干细胞(Cancer Stem Cells,CSCs)假说认为,肿瘤细胞中含有小部分细胞,它们具有无限自我更新和产生异质性肿瘤细胞的能力,对放化疗具有耐药性,是肿瘤发生发展的根源。目前治疗鼻咽癌的化疗药物以铂类为主,治疗毒性大,需要寻求更好的化疗药物。近年来有报道从桑叶中提取到了抗肿瘤的成分,但对于抗肿瘤干细胞方面,则鲜有报道。本课题组在前期研究中,通过系统分离,发现了桑叶中的一个提取部位SangA具有显著的抗肿瘤干细胞活性,但其主要的活性部位或成分尚不明确,其抗肿瘤干细胞的相关机理也有待进一步研究。实验目的:1.对SangA提取物进行系统分离,以抗肿瘤球生成为活性指导,筛选出具有抑制肿瘤干细胞作用的活性部位。2.对筛选出的活性部位是否特异性针对肿瘤干细胞进行评价。研究方法:1.柱层析法、薄层色谱法对SangA进行系统分离,高效液相色谱-质谱联用技术对各分离部位进行成分分析。2.通过肿瘤球形成实验,筛选各分离部位是否具有抗肿瘤干细胞活性,确认活性部位的主要化学成分。3.通过MTT实验、肿瘤细胞成球实验及二次成球实验、平板克隆实验、细胞划痕实验,评价上述筛选出的活性部位是否特异性针对肿瘤干细胞。结果:1.将十批SangA提取物进行系统柱分离,然后通过薄层色谱分析,进行批间合并和分组,得到活性部位20个,分成4组进行研究,分别为S1、S2、S3、S4。2.高浓度组中,活性部位S3、S4与对照组比较,S3、S4成球数分别为43.50±12.02个、11.33±2.31个(P<0.01),而S1、S2与对照组比较无明显差异;S3、S4 成球直径分别为 101.9630±12.6516μm、81.5108±4.7851μm(P<0.05),说明S3、S4能显著抑制鼻咽癌细胞CNE2肿瘤球的数量与大小,具有显著活性。3.化学成分分析表明,S3、S4中主要含有桑辛素类黄酮成分,且多以同系物或同分异构体的形式存在。4.经S3、S4处理后,普通贴壁鼻咽癌CNE2、5-8F细胞与对照组相比,平板克隆形成率均降低。5.贴壁生长细胞的划痕实验显示,S3、S4处理过后的普通贴壁鼻咽癌CNE2、5-8F细胞,细胞迁移率均比对照组小。6.S3、S4能更显著抑制鼻咽癌细胞增殖,而对正常鼻咽上皮细胞NP69无明显影响。7.MTT和肿瘤成球实验结果显示,S3、S4作用于CNE2贴壁细胞的IC50值分别为 136.87±30.37μg/ml、163.85±59.75μg/ml,作用于 5-8F 贴壁细胞的 IC50值分别为 182.73±8.60μg/ml、216.13±68.80μg/ml;而 S3、S4 作用于 CNE2 肿瘤球细胞的IC50值分别为1.04±0.14μg/ml、0.36±0.14 μg/ml;作用于5-8F肿瘤球细胞的IC50值为1.82±0.20μg/ml、0.18±0.02μg/ml。表明S3、S4针对鼻咽癌肿瘤球的活性显著高于贴壁细胞,在较低的浓度水平即能抑制肿瘤球的形成。8.肿瘤球二代成球实验显示,与对照组相比,经S3、S4处理后的鼻咽癌CNE2、5-8F肿瘤球细胞二代球成球数、成球直径均降低,并与第一代球加药量呈量效关系。9.经活性部位S3、S4处理后的鼻咽癌CNE2、5-8F肿瘤球细胞平板克隆形成率均显著降低。结论:1.SangA中抑制鼻咽癌干细胞的成分主要存在于S3、S4中,其主要含桑辛素类黄酮成分,可抑制鼻咽癌细胞成球能力。2.S3、S4对鼻咽癌干细胞的特异性显著高于普通鼻咽癌细胞。