流感病毒可引起急性呼吸道传染病并且该病毒每年都有不同规模的小流行,若干年一次全球范围的大流行,给人类健康和经济的发展带来负面影响。作为流感病毒表面包膜主要的两种糖蛋白血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase,NA),不但与病毒的致病性有关,同时HA和NA还要承受着外界环境的选择压力,在这些选择压力之下往往会引起HA和NA的变异,也会增加产生新型病毒的可能性。本研究共分为两个方面对流感病毒不同亚型的共同感染及流感病毒的进化进行描述。希望借此为阐明流感病毒流行规律提供新的依据。第一部分目的:了解一例新甲型H1N1和季节性H3N2亚型流感混合感染病例中季节性H3N2亚型流感病毒和新甲型H1N1亚型流感病毒的HA和NA基因的变异情况。方法:鼻咽拭子的核酸样本和细胞培养物100倍稀释的核酸样本经实时荧光PCR方法鉴定流感病毒亚型。病毒经MDCK细胞培养后进行红细胞凝集试验(HA)和红细胞凝集抑制试验(HI)。分离病毒毒株,提取核酸经逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增HA和NA基因,获得测序结果与WHO推荐的疫苗株和疫苗相似毒株同源比对,使用生物信息软件绘制种系发生树。结果:鼻咽拭子和细胞培养物实时荧光PCR检测为季节性H3N2阳性(CT值25.837 VS 15.675);新甲型H1N1阳性(CT值20.267 VS 25.169)。季节性H3N2 HI滴度为>1280,新甲型H1N1 HI滴度为80。通过与2013至2014年WHO推荐的疫苗株比对结果分离毒株的HA与A/Victoria/361/2011(H3N2)和A/Texas/50/2012(H3N2)的HA片段比较,氨基酸残基其同源性分别为96.7%和97.1%。与A/Texas/50/2012(H3N2)的NA片段同源性为99.6%。分离的新甲型H1N1亚型流感病毒毒株中HA与NA氨基酸残基与疫苗株A/California/07/2009(H1N1)比对,HA与NA片段的同源性分别为97.9%和97.8%。同时比对中发现无论季节性H3N2亚型还是新甲型H1N1流感病毒分离毒株HA和NA蛋白都出现了一些氨基酸位点的变异,而且一些位点涉及抗原决定区域。在NA序列比对中未发现如奥司他韦和扎那米韦等神经氨酸酶抑制类药物的耐药位点变异。结论:通过本研究说明在两种亚型共同流行期间,采用实时荧光PCR方法可检测人季节性H3N2和新甲型H1N1混合感染病例。并希望通过本次研究为流感的进一步预防和相关疫苗发展提供更多信息。第二部分目的:通过对甲型N9亚型流感病毒神经氨酸酶(NA)核苷酸进化趋势的研究,进而探寻新型H7N9亚型禽流感病毒产生的根源。方法:本次研究选取美国国立生物技术信息中心(NCBI)的甲型N9亚型流感病毒的NA序列,采用生物软件ClustalX 2.0和MEGA 6.0建立进化树形图。对其欧亚分支,采用BEAST软件2.1.2和Datamonkey interface在线软件,计算和分析选择压力和进化速率。采用Bioedit软件对NA的氨基酸置换熵值计算并分析。结果:系统进化树表明2013年新型H7N9亚型禽流感病毒可划分至现代欧亚分支之内,并且该分支的每位点每年核苷酸置换速率均值为3.8354×10-3,选择压力dN/dS均值为0.140413。16、19、40、53、81、84、112、256、335、359、401的氨基酸变异位点熵值>0.5。结论:研究分析表明2013年新型H7N9亚型禽流感病毒的NA片段基因可能来自甲型N9亚型流感病毒逐步进化的结果,最早可追溯到1996年的A/duck/Siberia/700/1996(H11N9)流感毒株,新型H7N9亚型禽流感病毒来源不是来自外界环境压力而突变的结果。