脑血管病是目前世界上发病率、致残率及死亡率最高的疾病之一,严重威胁着人们的身体健康和生活质量。缺血性脑血管病约占脑血管疾病的70～80%,它是一种常见的神经系统急性疾病。缺血性脑血管病治疗的基本策略就是要尽快让血流再通,使缺血脑组织恢复灌注,但血流再灌注后又可能导致神经细胞损伤进一步加重,反而出现更严重的脑功能障碍,这种现象被称之为脑缺血再灌注损伤。保护脑组织免受缺血再灌注损伤是缺血性脑血管病治疗的关注焦点之一。众多研究表明免疫相关的炎症机制在脑缺血再灌注损伤的病理生理过程中扮演着关键角色,其中,Toll样受体在脑缺血再灌注损伤的炎性级联反应激活中发挥重要作用,TLR4/NF-κB信号通路参与了脑缺血再灌注损伤中炎性反应的调节。基于免疫炎症机制在脑缺血再灌注损伤中的关键作用,目前众多研究正致力于探寻、研发具有抗炎及神经保护作用的药物。瑞香素是从瑞香科属植物中提取出来的一种具有抗炎作用的香豆素类衍生物,关于瑞香素在脑缺血再灌注损伤中是否表现出神经保护作用以及瑞香素是否能影响炎性反应的信号通路仍不明确。本研究选取小鼠为研究对象,运用大脑中动脉局灶性脑缺血再灌注损伤模型,旨在研究瑞香素在小鼠脑缺血再灌注损伤中的作用,并从神经炎性反应、细胞凋亡及对TLR4/NF-κB信号通路的影响这三个方面来探讨相关机制。本研究主要包括以下三个部分:第一部分小鼠脑缺血再灌注损伤模型的建立目的:探讨小鼠大脑中动脉局灶性脑缺血再灌注损伤模型的制作,总结经验。方法:将小鼠随机分为手术组和假手术组,每组16只,手术组运用线栓法构建大脑中动脉闭塞/再灌注模型,大脑中动脉闭塞缺血1小时后取出线栓,再灌注24小时。假手术组仅分离并结扎颈总动脉而不插入线栓,余操作步骤与手术组相同。再灌注24小时后,对小鼠进行神经行为学评分,作TTC染色以评估脑梗塞体积百分比,以干湿称重法测定脑组织含水量百分比。结果:假手术组小鼠术后无神经功能障碍的表现,神经行为学评分为0分,手术组小鼠存活15只,存活率为93.8%(15/16),其中无神经功能障碍的小鼠2只,其余13只表现出明显的神经功能障碍,神经行为学评分为2.43±0.65分,两组比较差异有显著统计学意义(P<0.001)。假手术组小鼠脑切片的TTC染色为均匀暗红色,无苍白色梗塞灶,脑梗塞体积百分比为0,而手术组小鼠的脑切片出现了左侧脑皮层及皮层下苍白色梗塞灶,脑梗塞体积百分比为36.64±5.12%,两组比较差异有显著统计学意义(P<0.001)。假手术组小鼠的脑组织左右半球对称,含水量百分比为63.32±7.85%,而手术组小鼠的脑组织体积增大,含水量百分比为89.17±8.38%,两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。造模总的成功率为81.3%(13/16)。结论:线栓法制作大脑中动脉局灶性脑缺血再灌注损伤模型操作简便,创伤较小,术后存活率高,且能够形成较稳定的脑组织缺血病灶。选择适当体重的小鼠、良好的麻醉、缩短手术时间以及控制好进栓方向及深度是建模成功的关键。第二部分瑞香素对小鼠脑缺血再灌注损伤神经保护作用的研究目的:研究瑞香素对小鼠脑缺血再灌注的神经保护作用。方法:将小鼠随机分为对照组和瑞香素低、中及高剂量组,每组12只,分别以5mg/kg、10mg/kg及20mg/kg的剂量于造模前30分钟经腹腔注射给药;对照组于造模前30分钟经腹腔注射等量生理盐水。运用线栓法制作大脑中动脉闭塞/再灌注损伤模型,大脑中动脉闭塞缺血1小时后取出线栓,再灌注24小时,然后对小鼠进行神经行为学评分,取脑组织作TTC染色以评估脑梗塞体积百分比。结果:与对照组相比,5mg/kg瑞香素组小鼠的神经行为学评分和脑梗塞体积百分比的差异无统计学意义(P>0.05),而10mg/kg及20mg/kg瑞香素组小鼠的神经行为学评分和脑梗塞体积百分比明显降低,差异有统计学意义(P<0.05),同时,两组间神经行为学评分和脑梗塞体积百分的比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:瑞香素在小鼠脑缺血再灌注损伤中表现出了神经保护作用,它能减轻脑缺血再灌注损伤后的神经功能障碍,降低神经行为学评分,并减小脑梗塞体积;10mg/kg及20mg/kg剂量的瑞香素均表现出了神经保护作用,两者比较无统计学差异,将10mg/kg作为后续研究选择的剂量。第三部分瑞香素对小鼠脑缺血再灌注损伤神经保护作用的相关机制研究目的:研究瑞香素对小鼠脑缺血再灌注损伤神经保护作用的相关机制。方法:将小鼠随机分为假手术组、脑缺血再灌注模型组、溶剂对照组以及瑞香素干预组,每组12只。假手术组仅分离并结扎颈总动脉而不插入线栓;脑缺血再灌注模型组以线栓法造模,余不作特殊干预;溶剂对照组于造模前30分钟经腹腔注射生理盐水;瑞香素干预组以10mg/kg的剂量于造模前30分钟经腹腔注射给药。再灌注24小时后,取患侧脑组织以ELISA法检测TNF-α和IL-1β的表达水平,以TUNEL法检测皮层细胞凋亡,以Western Blot法检测TLR4、NF-κB p65及IκBα的表达水平。结果:ELISA法检测显示模型组TNF-α和IL-1 β的表达水平明显高于假手术组,差异有显著统计学意义(P<0.001);与对照组相比,瑞香素组的TNF-α和IL-1β表达水平明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。TUNEL法检测显示假手术组TUNEL染色阳性的细胞较少,而模型组TUNEL染色阳性的细胞明显增多,差异有显著统计学意义(P<0.001);而与对照组相比,瑞香素组TUNEL染色阳性的细胞明显减少,差异有统计学意义(P<0.05)。Western Blot法检测显示模型组TLR4和NF-κB的表达水平明显高于假手术组,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01),与对照组相比,瑞香素组TLR4和NF-κB的表达水平明显降低,差异有统计学意义(P<0.05,P<0.05);同时,模型组IκBα的表达水平明显低于假手术组,差异有统计学意义(P<0.01),与对照组相比,瑞香素组IκBα的表达水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:瑞香素能下调脑缺血再灌注后炎症因子TNF-α和IL-1β的表达,并抑制细胞凋亡,同时,瑞香素能下调脑缺血再灌注后TLR4和NF-κB的表达,提示瑞香素可能通过抑制TLR4/NF-κB炎性信号通路的激活而发挥抗脑缺血再灌注损伤的神经保护作用。