恶性黑素瘤（melignant melanoma）,又称黑素瘤（melanoma）,以下简称恶黑,是来源于黑素细胞、痣细胞,恶性程度较高的恶性肿瘤;多发生于皮肤,亦可见于皮肤-粘膜交界处、眼脉络膜和软脑膜等处。在我国,恶黑的发病率明显低于欧美国家,但尚无具体的流行病学资料。在美国发病率每年递增3%,并且由于恶黑对大部分化疗药物抵抗、对放疗不敏感,而手术治疗仅对早期原位恶黑有效。因此,恶黑发病率虽然仅占皮肤恶性肿瘤的4%,死亡率却占其总数的79%。故现多主张对于有转移倾向的恶黑给予以手术治疗为主的、免疫治疗和基因治疗等生物疗法为辅的联合治疗。黑素细胞来源于外胚层的神经嵴,该细胞以及恶黑细胞均具有神经嵴衍生物所固有的某些特征。如黑素细胞具有神经元特有的形态学特征,细胞有较长的树枝状突起;某些痣细胞移入真皮后,形态学类似于周围神经系统的雪旺氏细胞;恶黑细胞具有神经嵴衍生物所固有的标记物,如原发性和转移性恶黑细胞内的外周蛋白、神经特异性烯醇化酶等标记物。近期有研究发现神经标记物微管相关蛋白-2（microtubule-associat-ed proteins 2,MAP2）在色素痣、恶黑的早期放射状生长阶段（radial growthphase,RGP）和垂直生长阶段（vertical growth phase,VGP）的细胞内高表达,而在转移性恶黑细胞内弱表达或表达缺失。MAP2是微管相关蛋白（microtubule-associated proteins,MAPs）家族中的成员之一。MAPs和微管蛋白（tubulin）是组成微管（microtubule,MT）的主要成分。MT是细胞骨架的主要结构成分之一,参与细胞的许多生理功能,如以纺锤体的形式参与细胞的有丝分裂。MAPs是一蛋白质家族,包括MAP1、MAP2、MAP3、MAP4、MAP5、MAP6等。MAP2是一组热稳定的磷蛋白,其同形异构体包括MAP2a、MAP2b、MAP2c、MAP2d及MAP2e。MAP2在脑内含量丰富,主要位于神经元的轴突和树突内。神经元内的MAP2主要生理功能为;①对神经元的树突生长以及极性获得起十分重要的作用;②与微管连接可使微管稳定性增加,形成较长的多聚体;③使微管成束,形成稳定的微管束;④干预运动蛋白与微管的相互联系,从而抑制细胞器转运。因此,我们推测;转移性恶黑细胞内MAP2的缺失或沉默,可能与其进展及转移有关,而MAP2的缺失或沉默可能会引起微管功能及性状的改变。因此,上调转移性恶黑细胞内MAP2的表达,则可能会通过稳定微管、使微管成束等机制,抑制肿瘤的增殖及转移。深入探讨体内、外MAP2的作用及其机制,阐明其在恶黑进展中的作用,将对设计新的恶黑治疗策略、建立新的基因治疗靶位具用重要意义。材料和方法一.材料;1.细胞系及其培养;人胚肾细胞系HEK293（中国军事医学科学院病毒所周育森教授惠赠）,人转移性恶黑细胞系WM451Lu（购自北大病理教研室）,鼠侵袭性恶黑细胞系B16C29（美国Wake Forest University,VijaysaradhiSetaluri教授惠赠）,鼠侵袭性恶黑细胞系B16（大连医科大学组胚教研室惠赠）。其中,人胚肾细胞HEK293用含10%胎牛血清、100u/ml青霉素、100u/ml链霉素的DMEM高糖培养基,鼠侵袭性恶黑细胞B16C29及B16、人转移性恶黑细胞WM451Lh用含10%胎牛血清、100u/ml青霉素、100u/ml链霉素的RPMI-1640培养基于5%CO₂,37℃条件下培养。2.试剂;一抗;抗鼠MAP2单克隆抗体、抗鼠绿色荧光蛋白（GFP）单克隆抗体,（美国,Sigma公司）;二抗;异硫氰酸荧光素（FITC）标记的抗鼠单克隆抗体（丹麦,Dako公司）,德克萨斯红（Texas Red）标记的羊抗鼠多克隆抗体（英国,Amersham Life Science）,藻红蛋白标记的兔抗鼠多克隆抗体（美国,Sig-ma公司）;Annexin V-异硫氰酸荧光素（Fluorescein isothiocyanate,FITC）凋亡检测试剂盒（美国,Becton Dickinson公司）;小牛血清、DMEM高糖培养基、RPMI-1640培养基（杭州,四季青生物材料公司）;腺病毒-MAP2载体（adenovirous-microtubule-associated protein 2,Ad-MAP2）（美国,WakeForest University,Vijaysaradhi Setaluri教授惠赠）;Boyden小室、人工基底膜胶（matrigel）（美国,Becton Dickinson公司）。3.动物;Balb/c裸鼠,6-8w鼠龄,体重18g～20g,雌性,在恒温（25～27℃）恒湿（45%～50%）的半屏障系统环境下饲养。二.方法（一）腺病毒载体制备与检测1.Ad-MAP2的扩增;采用HEK293细胞大量复制腺病毒2.CsCl密度梯度超速离心法纯化Ad-MAP23.空斑法测定腺病毒载体Ad-MAP2滴度4.转染效率测定（二）体外实验1.MAP2体外抑制肿瘤细胞增殖的实验研究1.1 MTT检测细胞增殖效应1.2细胞生长曲线测定2.MAP2体外诱导肿瘤细胞凋亡及阻滞细胞分裂周期的实验研究2.1应用流式细胞术检测Ad-MAP2转染入恶黑细胞后细胞的凋亡情况2.2用流式细胞仪对转染Ad-MAP2后,恶黑细胞内DNA进行定量分析,再结合Modfit分析软件推算各细胞周期相的分布。3.MAP2体外表达对细胞内微管性状及恶黑细胞形态学的影响的实验研究3.1光镜下观察转染后细胞形态学改变3.2电镜下观察转染后细胞形态学改变及细胞内微管性状的改变4.MAP2体外抑制肿瘤侵袭的实验研究以Boyden小室模型及人工基底膜胶模拟细胞外基质,研究恶黑细胞侵袭力的改变。（三）体内试验1.恶黑动物模型建立2.免疫组化法检测瘤内MAP2表达3.MAP2体内抑瘤作用研究4.MAP2体内表达对恶黑细胞内微管性状影响的研究结果1.MAP2体外对鼠侵袭性恶黑细胞B16C29及人转移性恶黑细胞WM451Lu的生长具有抑制作用;自转染后的第6天开始,Ad-MAP2组的上述两种细胞数明显低于阴性对照组,转染后的第9天差异更为显著,表明恶黑细胞的生长受到抑制。2.MAP2体外对鼠侵袭性恶黑细胞B16C29形态的影响;光镜下观察,Ad-MAP2转染该细胞后第4天,细胞的树突开始变长、变细、延伸。第5天变化更为明显,细胞呈树枝状形态。对照组细胞形态未见明显改变。3.MAP2体外对鼠侵袭性恶黑细胞B16C29内微管性状的影响;透射电镜下观察,转染MAP2基因6天后,细胞胞体延伸出长而细的突起,突起内大量的微管形成;与对照组相比,微管明显变长,变粗,集合成束的微管数量增多,并沿细胞突起向前延伸。4.MAP2体外诱导鼠侵袭性恶黑细胞B16C29、B16凋亡;应用流式细胞术检测发现,Ad-MAP2转染6天后上述两种细胞出现凋亡。转染组B16C29细胞总凋亡比率为21.34%、B16细胞为17.06%,明显高于阴性对照组。5.MAP2对鼠侵袭性恶黑细胞B16C29、人转移性恶黑细胞WM451Lu周期的影响;与阴性对照Ad-GFP组相比,经Ad-MAP2转染的上述两种细胞的G0/G1期、G2/M期细胞比例降低,且G2/M期降低较为明显,而S期细胞比例增加,与对照组相比有显著差异。6.MAP2体外对鼠侵袭性恶黑细胞B16C29及人转移性恶黑细胞WM451Lu侵袭力的影响;Boyden小室侵袭模型中,与阴性对照Ad-GFP组比较,MAP2组上述两种细胞侵袭力明显下降。7.MAP2体内抑瘤作用;分别以鼠侵袭性恶黑细胞B16C29及人转移性恶黑细胞WM451Lu建立裸鼠恶黑动物模型。从注射病毒后第6天始,注射Ad-MAP2裸鼠的皮下肿瘤较阴性对照Ad-GFP组生长缓慢,存在显著性差异。8.MAP2体内转染对恶黑细胞内微管性状的影响;鼠侵袭性恶黑细胞B16C29及人转移性恶黑细胞WM451Lu建立的裸鼠恶黑动物模型中,与阴性对照Ad-GFP相比,转染Ad-MAP2组的肿瘤组织电镜下观察发现,恶黑细胞内微管明显变长,变粗,集合成束数量增多。结论1.MAP2体外对鼠侵袭性恶黑细胞B16C29及人转移性细胞WM451Lu的生长具有抑制作用。2.MAP2超表达可使鼠侵袭性恶黑细胞B16C29、B16细胞分裂周期停滞于G2/M期,诱导恶黑细胞凋亡。3.体外MAP2超表达可使类椭圆形的恶黑细胞树突明显变长、变细、延伸,恢复正常黑素细胞树枝状形态;同时,细胞树突内微管明显变长、变粗、微管聚集成束数量增多.恶黑细胞形态学改变的发生机制可能与树突内微管性状的改变有关。4.MAP2体外超表达可降低恶黑细胞的侵袭力,而其发生机制可能与细胞形态及细胞内微管性状的改变有关。5.动物实验发现MAP2体内超表达亦可抑制恶黑肿瘤的增殖;细胞树突内微管明显变长、变粗、微管聚集成束数量增多.进一步验证了体外实验的结果。