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恶性胶质瘤细胞对放疗、化疗不敏感,导致其临床治愈率低,术后复发率居高不下,患者5年存活率不到5%。因此,探寻该疾病行之有效的治疗途径,发现相应的生物学治疗途径至关重要。胶质瘤干细胞(glioma stem-like cells,GSLCs)是胶质瘤组织中存在的极少数具有高度抵抗放疗和化疗的细胞,具有无限增殖和多向分化能力,可以分化为神经元表型细胞,星形胶质细胞表型细胞以及少突胶质细胞表型细胞。GSLCs概念的提出为胶质瘤治疗提供了重要靶点,因此寻找能够促进GSLCs定向分化药物可能为临床治疗胶质瘤提供新的途径。流行病学调查发现一个有趣的现象:精神分裂症患者的肿瘤发病率比正常人群明显减少。研究人员发现多种抗精神病药如氯丙嗪、奥氮平、利培酮等,均能明显抑制胶质母细胞瘤细胞系IMR32细胞增生,且对正常细胞影响甚微。喹硫平(Quetiapine,QUE)是继氯氮平、利培酮和奥氮平之后的第4个非典型抗精神病药物。本课题组前期研究首次发现喹硫平能显著增加神经干细胞(neuronal stem cells,NSCs)分化为少突胶质细胞的比例,并能进一步促进少突胶质细胞的成熟及髓鞘形成。我们在实验中还发现QUE能促进少突胶质前体细胞(oligodendrocyte progenitor cells,OPCs)分化成熟,考虑GSLCs与NSCs,OPCs关系密切,我们提出QUE可能具有抑制GSLCs增殖及促进GSLCs定向分化为少突胶质细胞表型的潜能。本研究利用GSLCs培养和移植成瘤模型,研究了QUE对胶质瘤发生发展的作用,及其与胶质瘤一线治疗药物替莫唑胺(Temozolomide,TMZ)的联合药效,探讨了QUE对GSLCs增殖分化的调节作用及可能的分子机制研究总共分为三个部分:第一部分:喹硫平抑制胶质瘤生长的作用利用无血清条件培养系统从胶质母细胞瘤细胞系GL261中筛选获得胶质瘤干细胞,建立胶质瘤原位及皮下成瘤模型,分别采用QUE、TMZ以及二者联合治疗等方式,运用荧光素酶活体成像技术、动物行为学、HE染色、免疫组织化学和Western blot等方法检测各种治疗方式对胶质瘤发生和生长特性的作用。最后为了进一步检验QUE可能作用于GSLCs而抑制胶质瘤的产生或生长。我们分别对GSLCs移植裸鼠皮下成瘤以及脑室成瘤后使用TMZ 21天来杀死肿瘤细胞,停药后再分别给予生理盐水和QUE治疗,利用荧光素酶活体成像技术观察胶质瘤的生长情况。主要结果如下:1.免疫荧光染色显示无血清培养条件下筛选GL261获得的细胞表达肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)标记物CD133、Sox2、NG2和Nestin,加入10%胎牛血清分化10天后大部分细胞表达神经胶质酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP),少部分表达髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)。以上结果表明所获得细胞具有胶质瘤干细胞特性,为胶质瘤干细胞GSLCs。2.GSLCs皮下移植裸后7天后可见小的瘤体形成,21天后瘤体平均直径达到1.5cm,而QUE处理组、TMZ处理组及QUE联合TMZ组,成瘤时间均有所推迟,瘤体平均体积也小于对照组,其中尤以QUE联合TMZ疗效最明显。组织学病理检测发现,治疗组明显减少了胶质瘤细胞的分裂潜能,即核分裂像减少,增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)阳性细胞明显减少。而同对照组相比,治疗组,尤其是QUE和TMZ联合治疗组,Olig2阳性细胞明显减少,而MBP阳性细胞则明显增多(P<0.01)。Western blot结果显示QUE和QUE联合TMZ治疗组MBP表达明显增多,而Vimentin,GFAP表达下降(P<0.05)。3.GSLCs脑室移植后,活体荧光成像显示小鼠于1周后出现肿瘤,而QUE,TMZ治疗后肿瘤大小有所减少,而二者联合用药后肿瘤最小,动物成活率增加。行为学旷场实验显示,药物治疗组小鼠较原位脑胶质瘤模型小鼠活动总路程明显提高(P<0.05),提示其活动能力保留较好。QUE对胶质瘤生长有抑制作用,而且QUE联合替莫唑胺能更好抑制胶质瘤生长,降低其恶性程度。4.TMZ治疗21天后肿瘤生长明显抑制,但停药后1周后,残留的胶质瘤干细胞开始生长至瘤。而QUE处理组,肿瘤生长明显减慢,大小明显减小(P<0.05)。说明QUE可能抑制GSLCs增殖或促进其分化。本部分实验说明QUE对胶质瘤的生长有一定的抑制作用,而且QUE联合替莫唑胺能更好抑制胶质瘤生长,降低其恶性程度。这些结果提示QUE可能对GSLCs生长分化有一定的影响。第二部分:喹硫平对肿瘤干细胞增殖及分化的作用为了证明QUE可能作用于GSLCs而抑制胶质瘤干细胞的产生或生长。我们利用无血清条件培养系统从胶质母细胞瘤细胞系GL261中筛选获得胶质瘤干细胞,用MTT,RT-PCR,流式细胞检测等技术观察不同浓度QUE对胶质瘤干细胞增殖作用。用免疫荧光及Western blot来检测不同浓度QUE对胶质瘤干细胞分化作用。主要结果如下:1.体外实验显示QUE浓度50、100μmol/L能明显抑制GSLCs的生长,悬浮的球团明显小于对照组(P<0.01)。MTT实验也证实了QUE的抑制效应(P<0.01)。流式细胞检测中QUE明显减少S期细胞(P<0.05),而且能显著减少胶质瘤干细胞中Sox2及Ki67的基因表达(P<0.01)。2.以1%胎牛血清诱导GSLCs分化过程中,QUE处理可显著提高少突胶质细胞成熟蛋白MBP及CC1阳性细胞数;而且浓度依赖性降低干细胞因子Sox2,Olig2蛋白表达(P<0.05),而升高少突胶质细胞相关因子MBP,Olig1蛋白表达(P<0.05)。本部分实验结果表明QUE能抑制胶质瘤干细胞增殖并且能促进其向类似少突胶质细胞分化。第三部分:喹硫平促进胶质瘤干细胞分化的分子机制初探由于Wnt/β-catenin通路在GSLCs增殖分化中发挥了至关重要的作用,而且QUE的抗精神病的药物机制也涉及该途径,所以我们利用免疫组化及Western blot等技术检测了离体在体中QUE对胶质瘤干细胞分化中Wnt/β-catenin信号通路的影响。主要结果如下:1.在体实验中,免疫组化显示对照组β-catenin在细胞质表达较多并且有入核现象,而QUE组中β-catenin在细胞质表达较少。Western blot显示QUE组中p-GSK-3β(ser9)减少(p<0.01),促进β-catenin降解,导致β-catenin表达减少(p<0.01)。2.在胶质瘤干细胞分化过程中,QUE可以减少p-GSK-3β(ser9)的表达,提高磷酸化β-catenin(P-β-catenin)而降低β-catenin水平(P<0.05)。这种作用呈时间浓度依赖性。而且这种作用可以被Wnt/β-catenin通路激活剂QS11和Li Cl拮抗。本部分实验说明QUE可能通过激活GSK-3β,使β-catenin降解,进而抑制Wnt/β-catenin通路而促进GSLCs向少突胶质样细胞分化。以上所有结果提示QUE有可能成为与TMZ联合用药的候选,为恶性胶质瘤的治愈提供新的策略。