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三色堇(Viola × wittrockiana)是堇菜科(Violaceae)堇菜属(Viola)的二年生花卉,为冬天常见的园林绿化植物,其色斑遗传稳定,色斑边界明显,为研究花色遗传以及花斑形成机理的理想材料,本课题组在之前研究中发现酪氨酸脱羧酶(VwTYDC)在色斑区以及非色斑区表达有着明显的差异,推测酪氨酸可能为三色堇中花青素形成的一个潜在因素,使得酪氨酸可能成为一个促进花斑形成机理的新型研究方向。因此,为揭示酪氨酸对三色堇花斑形成的分子机制及转录组特征,探究酪氨酸影响三色堇花青素的合成途径,本实验以黄底黑斑三色堇品种’梦蝶’为实验材料,运用转录组学的方法,以清水为对照,采用3 mM酪氨酸处理三色堇非色斑区,并进行转录组测序,挖掘三色堇中酪氨酸与花青素合成相关可能存在的途径,并进行关键基因的qPCR和病毒介导的基因沉默(VIGS)验证实验,为今后三色堇的花色育种以及遗传信息的改良提供新的思路。具体研究结果如下:(1)获得19 438条表达显著差异基因,其中13 037条上调,6401条下调。在花青素相关合成途径中,有9个花青素合成基因差异表达:(2)将各类转录因子与拟南芥转录因子进行聚类分析,挖掘与花色相关的转录因子,其中与花色相关的转录因子中有1个MYB转录因子差异表达,1个bZIP转录因子差异表达;(3)转录组数据分析发现外源施加酪氨酸能促进脱落酸的形成,而脱落酸又能促进花青素合成的机理;(4)利用qPCR技术对9个花青素合成途径中的合成基因及2个关键转录因子进行分析验证,确定了外源施加酪氨酸能够促进三色堇花青素合成途径中合成基因表达量的上调;(5)利用qPCR技术对脱落酸处理条件下花青素合成基因及关键转录因子进行验证,确定了 ABA处理条件下三色堇花青素合成基因VwCHS、NVwAS、VwUGT以及MYB转录因子Unigene0005403和bZIP转录因子的Unigene0087548基因的表达量上调;(6)构建 pTRV2-VwTYDC、pTRV2-VwANS 重组 VIGS 载体,通过农杆菌介导导入三色堇植株中,研究发现沉默VwCHS以及VwANS后三色堇花瓣色斑区由块状色斑变为条纹状色斑,沉默VwTYDC后三色堇花瓣有明显的花青素的积累,证明酪氨酸与三色堇花青素合成密切相关;(7)提出三色堇中可能存在的酪氨酸促进花青素合成的调控网络。研究结果表明,外源添加酪氨酸的条件下能促进三色堇中花青素含量的积累以及花青素合成基因以及相关转录因子表达量的增加,同时,外源施加酪氨酸能够通过其他途径增加ABA的含量促进花青素合成和色斑的形成。