5-氟尿嘧啶（5-Fluorouracil,5-Fu）是治疗多种实体瘤（包括胃肠道肿瘤、乳腺肿瘤、头颈部肿瘤等）最常用的药物之一。作为一种抗代谢药物,5-Fu杀伤肿瘤细胞的同时也可损伤机体快速增殖的正常细胞（如小肠细胞）,约50%以上接受5-Fu化疗的癌症患者出现肠道粘膜炎。肠道黏膜炎可导致中性粒细胞减少、营养不良、肠道菌群失调,甚至可能引发全身感染和败血症风险,严重影响癌症患者的生活质量。根据5-Fu所致肠道粘膜炎发病机制,寻找有效对抗的药物是解决这一副作用的根本措施。穿心莲是我国常见传统中药,性味苦,寒。归心、肺、大肠、膀胱经。具有清热、解毒、燥湿、凉血、消肿等功效。适用于感冒发热,口舌生疮,泄泻痢疾,热淋涩痛等。中医学认为,“泄泻”多责之于脾胃,腹泻者脾失运化,水湿下注。所以,穿心莲清热燥湿功效为应对5-Fu相关泄泻的湿热之邪提供了中医理论基础。穿心莲内酯（Andrographolide,Andro）是穿心莲中主要有效成分之一,别名穿心莲乙素,是一种二萜内酯类化合物。近几十年来,Andro及其制剂因其抗病毒和抗炎作用在中国、东南亚等国家广泛应用。研究表明,Andro及其类似物可以缓解小鼠溃疡性结肠炎及番泻叶、蓖麻油引起的肠道腹泻。然而,穿心莲内酯是否能够减轻5-Fu引起的肠道粘膜炎及其相关腹泻症状尚未可知。基于此,本研究通过构建合适的5-Fu所致肠道损伤小鼠模型,探讨Andro对5-Fu相关肠道损伤的保护作用及潜在分子机制,为该药在5-Fu相关肠道损伤的临床应用奠定理论基础。第一部分:5-Fu所致肠道损伤小鼠模型的构建与评价目的:评估不同剂量5-Fu对小鼠肠道损伤的影响,并探讨其剂量-反应关系,以确定5-Fu所致肠道损伤小鼠模型的合适剂量。方法:本实验选用雄性BALB/C小鼠42只,5-Fu不同剂量（0 mg/kg,25 mg/kg,50 mg/kg,100 mg/kg,200 mg/kg,400 mg/kg）连续腹腔注射 5 天,研究以下指标:（1）观察小鼠的体重变化、腹泻情况、生存状况;（2）运用HE染色考察5-Fu处理小鼠回肠、结肠的病理变化,包括绒毛高度及隐窝发育情况等;（3）ELISA测定血浆二胺氧化酶（diamine oxidase,DAO）水平;（4）TUNEL法检测回肠/结肠凋亡水平;（5）western blot法考察回肠和结肠中Bax、Bcl-2和caspase 3相关蛋白表达水平。结果:5-Fu给药组的小鼠体重在造模期间逐渐下降,且剂量越高,体重下降越快。同时随着5-Fu剂量的增加,腹泻症状加重,小鼠死亡率增加,以5-Fu 200mg/kg及400 mg/kg最为严重,25 mg/kg 5-Fu的致腹泻作用不显著。HE染色发现,小鼠的组织病理学损伤伴随5-Fu剂量增加而愈加严重。5-Fu处理组小鼠血浆DAO活性下降,该作用也呈现剂量依赖性。TUNEL染色显示,5-Fu诱导了小鼠回肠和结肠的细胞凋亡,以高剂量组最为明显,而25 mg/kg未能诱导显著的肠道病理损伤和细胞凋亡。Western blot分析表明5-Fu诱导肠道损失可能与上调Bax和caspase 3,下调 Bcl-2 有关。结论:5-Fu诱导的肠道损伤呈剂量依赖性。50 mg/kg～100 mg/kg的5-Fu能够保证实验小鼠肠道病理损伤、腹泻及适当的生存率,是诱导小鼠5-Fu相关肠道粘膜炎模型并评价药物疗效的合适剂量。第二部分:穿心莲内酯缓解5-Fu所致肠道损伤的作用研究目的:探讨穿心莲内酯（Andrographolide,Andro）对5-Fu所致肠道粘膜炎的影响,并初步探讨其可能的机制。方法:将49只雄性BALB/C小鼠随机分为7组,分别为正常对照组、模型组（5-Fu 100 mg/kg,ip,连续 5 天）、洛哌丁胺组（洛哌丁胺 3 mg/kgig+5-Fu l00mg/kg ip,连续 5 天）、Andro 治疗组（Andro 25mg/kg 或 50mg/kg 或 100mg/kg,ig+5-Fu 100mg/kg ip,连续 5 天）,Andro 高剂量对照组（Andro 100mg/kg,ig,连续 5天）。)观察各组小鼠的体重变化、腹泻情况、生存状况;HE染色考察Andro对5-Fu处理小鼠回肠、结肠的病理变化（包括绒毛高度及隐窝深度）的影响。TUNEL法和PCNA法检测细胞凋亡和增殖情况。Western blot检测p38,p53,Bax,Bcl-2,caspase8/caspase3等凋亡相关蛋白的表达,分析Andro对肠道损伤保护作用的初步机制。结果:Andro显著改善5-Fu导致的小鼠体重减轻和腹泻状况,效果呈剂量依赖性。HE染色结果表明,Andro能够显著缓解5-Fu导致的小肠组织病理学损伤,绒毛高度、隐窝深度的降低等均有所改善。TUNEL及PCNA染色结果表明,Andro能够显著改善5-Fu导致的肠道细胞凋亡,并促进肠道上皮细胞的增殖。进一步Western blot结果发现,5-Fu导致小鼠p38、p53的磷酸化水平增加,活化的caspase3、caspase8表达水平增强,Bax蛋白表达增加,Bcl-2的表达降低。不同剂量的Andro均能够显著改善5-Fu所致上述相关蛋白的异常,表现出明显的抗凋亡效果。给予正常小鼠Andro（100mg/kg）,对小鼠的生存状态、体重变化及肠道病理结构无显著影响。结论:Andro能够显著减轻5-Fu诱导的小鼠肠道损伤,改善小鼠体重减轻及腹泻情况,这种作用可能跟其对p38凋亡通路的抑制有关。第三部分:穿心莲内酯抑制p38 MAPK通路缓解5-Fu所致肠道损伤的体外验证目的:采用NCM460细胞对Andro缓解5-Fu所致肠道损伤的疗效进行体外验证,并探究p38 MAPK通路在其中发挥的作用。方法:用不同浓度的5-Fu处理NCM460细胞,探索最佳体外造模剂量。采用不同剂量的Andro（5μM,10μM,20μM）进行干预,CCK-8检测NCM460细胞活性;流式细胞技术检测NCM460细胞在药物干预后的凋亡情况;western blot检测p38,p-p38,caspase8,cleaved caspase8等相关凋亡蛋白的表达水平。加用p38抑制剂SB203580（10μM）或p38激动剂积雪草酸（30μM）,进行细胞凋亡和凋亡蛋白测试等验证实验。结果:5-Fu在体外实验中能够剂量依赖性地增加NCM460细胞凋亡。其中,10μM 5-Fu对细胞抑制率达到42.37%±6.26%,因此被用于后续的实验研究。5-Fu显著上调NCM460细胞的p38和p53磷酸化表达,增加活性的caspase8/3表达,Bax表达上调和Bcl-2表达下调。而Andro的使用可明显缓解上述改变,与第二部分体内实验结果一致。加用p38激动剂积雪草酸可部分逆转Andro对5-Fu诱导NCM460细胞凋亡的保护作用,western blot结果显示积雪草酸阻断了 Andro对p-p38以及下游通路cleaved caspase8的下调。结论:p38MAPK通路的激活是5-Fu相关肠道损伤的重要机制。Andro通过下调p38MAPK,进而抑制凋亡相关效应蛋白的表达,从而改善5-Fu导致的肠道细胞凋亡。第四部分:穿心莲内酯对5-Fu在小鼠体内药动学及药效学的影响目的:考察联合应用Andro对5-Fu在小鼠体内药动学及抗肿瘤效果的影响。方法:建立小鼠血浆中5-Fu的血药浓度的HPLC-MS/MS测定方法。将小鼠280只随机分为 4 组:5-Fu（100 mg/kg）单次给药组、Andro（100 mg/kg）+5-Fu（100 mg/kg）单次联用组、5-Fu（100 mg/kg）连续给药组、Andro（100 mg/kg）+5-Fu（100 mg/kg）连续联用组,按时间点采集血样处理并计算5-Fu的药代动力学参数。另外,采用雄性BALB/C小鼠24只,腋下接种H22细胞,建立移植瘤模型,并将动物随机分为4组:移植瘤对照组、5-Fu（100 mg/kg）组、Andro（100 mg/kg）组、5-Fu（100 mg/kg）+Andro（100 mg/kg）组,记录小鼠体重变化及瘤重。结果:5-Fu在小鼠血浆中血药浓度测定的线性范围为0.05-100 μg/mL;批内、批间精密度RSD值均小于15%,经药动学分析可知,联合应用Andro对5-Fu的药代动力学参数均未产生显著影响。与移植瘤对照组相比,单用5-Fu及Andro均能显著抑制小鼠H22移植瘤的生长,Andro联合5-Fu给药可增强5-Fu对荷瘤小鼠的抗肿瘤作用,但与单独给予5-Fu组相比,无显著性差异（P>0.05）。结论:联合使用Andro不影响5-Fu在小鼠体内的药动学过程,也不影响5-Fu在荷瘤小鼠体内的抗肿瘤效果。