研究背景及目的：脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性恶性肿瘤,约占脑内所有恶性肿瘤的80%,其中恶性程度和发病率最高者(65%)为胶质母细胞瘤(GBM, WHO IV级)。其预后不佳,死亡率极高,使恶性胶质瘤成为目前神经外科疾病治疗的重点和难点。传统的治疗策略包括手术切除及辅以术后放化疗,以替莫唑胺(TMZ)联合放疗为标准方案的术后辅助治疗也在一定程度上延长了患者总体生存时间(OS)。然而由于胶质瘤高度复发、恶性侵袭的特性及TMZ等化疗药耐药等因素,GBM和间变型胶质细胞瘤(WHO Ⅲ级)患者中位生存时间仍然分别只有12～15个月和2-5年。如何改善胶质瘤患者的预后一直是神经外科领域的难题。随着分子生物学和基因组学的发展,对与肿瘤发生过程中的基因事件及分子机制的研究也更加深入,靶向肿瘤细胞内核心信号通路中的关键分子,抑制受体激活、阻断信号传导等,从而抑制肿瘤血管生成和肿瘤生长,促进肿瘤细胞凋亡,已成为肿瘤研究的热点。由此,阐明胶质瘤的分子病理机制,寻找能够有效治疗胶质瘤的关键分子靶点显得十分重要。高通量技术的快速发展无疑为实现分子靶向治疗提供了强有力的支持。利用二代测序、基因芯片、组织芯片等技术,分析肿瘤样本中基因及分子水平变化,结合详细患者随访资料,比较病例的疗效及生存时间迥异,进而筛选出差异表达基因,是寻找肿瘤分子靶标的可靠手段。TCGA数据库即是在此背景下由美国国家癌症研究所和美国国家人类基因组研究所于2005年共同发起建立,旨在通过高通量技术研究加深对肿瘤分子基础的理解,而GBM是该项目重点聚焦并最先开展深入研究的肿瘤。通过聚类分析、差异表达分析和生存分析,整合脑胶质瘤患者的基因芯片数据及TCGA数据库中GBM样本的基因表达谱数据和患者临床相关资料,以此寻找那些在脑胶质瘤中表达异常并与患者预后相关的基因。这些结果不仅能够有助于我们理解脑胶质瘤发生的分子病理机制,同时还可能揭示一些对脑胶质瘤预后有判断价值的分子标记物,进而帮助实现真正意义上的个体化治疗。G-蛋白偶联受体-65(GPR65)为G-蛋白偶联受体(GPCRs)家族中的一个重要成员,是一类敏感的质子传感器。既往研究显示恶性肿瘤细胞生长代谢迅速,造成氧乏进入糖酵解途径产能,含有大量乳酸的代谢产物堆积,使得肿瘤细胞周围形成微酸性环境。GRP65能够感受这种细胞外环境中pH的变化,及时调整下游能量代谢和协调炎症反应、免疫应答等过程,从而使肿瘤细胞获得更多的生存优势,促进肿瘤细胞增殖。然而,目前国内外文献中均无GPR65在胶质瘤中相关的研究报道。我们拟通过数据库及多样本信息筛选及验证GPR65对胶质瘤患者预后判断的价值,并利用体外实验研究GPR65在胶质瘤恶性增殖中的作用机制。研究方法及结果：前期我们收集了15例的胶质瘤样本,经病理证实WHO Ⅰ级1例,WHO Ⅱ级7例,WHO Ⅲ级2例及WHO Ⅳ级5例,并对患者进行随访获得生存期,截止随访终点,共有7名患者死亡,8名患者仍健在,15名患者生存期为5-85个月,中位生存时间65个月。继而将肿瘤组织裂解、抽提RNA及转化cDNA,制备成基因芯片,通过杂交测序方法获得表达谱基因信号值。根据患者随访截止时的生存状态分组,对两组患者的每个基因进行t检验、差异倍数计算及热图分析,在p值小于0.015水平,两组间基因表达差异2倍时,发现134个基因能够明确区分预后不同的两组胶质瘤患者。在TCGA的528例GBM及10例正常脑组织中,我们利用秩和检验、Kaplan-Meier生存分析及log-rank检验来验证这134个基因在肿瘤中的表达及与患者生存期的相关性。经过逐个基因验证分析,我们发现GPR65在GBM组织中表达明显上调(p<0.001),并与患者的生存期明显相关,GPR65高表达者中位OS明显短于低表达者(中位OS 11.7个月vs.14.2个月,p=0.003)。通过在自主建立的基因芯片及公开的TCGA数据库中初步筛选,我们发现GPR65基因在胶质瘤中表达明显上调,并可作为预后因子预测GBM患者预后,提示其可能在胶质瘤发生及进展过程中扮演重要角色。随后,我们收集经病理证实的300例胶质瘤样本(WHO Ⅰ级11例,WHO Ⅱ级109例,WHO Ⅲ级47例,WHO Ⅳ级133例)及16例正常脑组织制备成高通量组织芯片,并对脑胶质瘤患者跟踪随访,再利用免疫组化的方法进一步验证GPR65的表达及预后判断作用。随访结果显示285名患者获得完整随访数据,截止2013年9月随访结束,39.3%患者仍存活,35.4%患者影像学未见明显肿瘤复发,患者中位总体生存时间(OS)为30个月,中位无进展生存期(PFS)为26个月。免疫组化显示GPR65主要定位于靶细胞的细胞浆,其在脑胶质瘤中表达水平明显上调(免疫组化得分4.295±3.063 vs.1.00±1.225,p<0.001)。Kaplan-Meier生存曲线显示117例GPR65高表达患者的中位OS及中位PFS均明显短于164例GPR65低表达患者(OS：15个月vs.34个月,p<0.001；PFS：12个月vs.30个月,p<0.001)。进一步的分层分析指出,在102例原发GBM患者中,GPR65的高表达(58/102)也预示着较短的中位OS及中位PFS(OS：11个月vs.14个月,p=0.01；PFS：8个月vs.11个月,p=0.022)。多因素Cox比例风险回归显示,GPR65表达是原发GBM患者OS(Hazard Ratio=1.599,95%CI 1.028-2.487, p=0.037)及PFS (Hazard Ratio=1.593,95%CI 1.036-2.450, p=0.034)的独立预测因子。为了进一步研究GPR65在胶质瘤中多发挥的具体功能,我们首先利用慢病毒感染的方法构建了干扰和过表达GPR65基因及空载质粒对照的脑胶质瘤细胞系U251。荧光显微镜、定量PCR及Western blot实验证实GPR65干扰和过表达效果稳定。继而再通过CCK-8法检测细胞增殖曲线变化、克隆形成实验检测肿瘤细胞克隆形成能力变化、流式细胞仪测肿瘤细胞周期比例变化等。结果发现改变内源性GPR65表达水平后,对空载质粒对照组相比,GPR65过表达可促进胶质瘤细胞增殖及提高克隆形成能力；GPR65敲减后胶质瘤细胞增殖速率及克隆形成能力明显下降,且细胞周期被阻滞在G2期。结论：综上所述,我们通过芯片及TCGA大数据分析结合临床组织样本筛选,验证了GPR65基因在脑胶质瘤中表达上调,可判断胶质瘤患者的临床预后,是原发GBM患者预后的独立预测因子。同时,体外实验证实GPR65可促进胶质瘤恶性增殖。由此,GPR65可作为胶质瘤分子靶向治疗的候选靶点行值得进一步研究。