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目的:以中医药理论为指导,结合传统中医文献与现代药理毒理学研究方法,选用补骨脂+肉豆蔻和补骨脂+核桃仁2种常用配伍,运用体内外适宜技术,从整体动物、离体靶器官和细胞3个水平系统研究配伍肉豆蔻、核桃仁对补骨脂肝毒性效应的影响,初步探讨配伍肉豆蔻、核桃仁对补骨脂肝毒性“量-时-毒”关系、离体肝脏毒性和肝细胞毒性的影响,以期为指导补骨脂临床合理用药提供实验依据。方法:运用经典的急性毒性实验方法,进行补骨脂+肉豆蔻和补骨脂+核桃仁配伍对正常小鼠急性毒性的影响研究;采用小鼠单次灌胃给药方法,进行补骨脂+肉豆蔻和补骨脂+核桃仁配伍对正常小鼠肝毒性“量-时-毒”关系的影响研究,观察小鼠死亡情况和毒性反应,检测药后血清ALT、AST水平,计算肝脏系数,并进行肝脏大体病理学和病理组织学检查;运用常规大鼠离体肝脏灌流方法,进行补骨脂+肉豆蔻和补骨脂+核桃仁配伍对正常大鼠离体肝脏灌流的影响研究,检测药后灌流液ALT、AST水平,排除其他组织器官的干扰,控制药物浓度,定量比较配伍肉豆蔻、核桃仁对大鼠离体肝脏的毒性损害;采用CCK8法,进行补骨脂+肉豆蔻和补骨脂+核桃仁配伍对L02细胞的影响研究,观察对L02细胞生长的影响,检测药后细胞上清液ALT、AST、LDH水平,比较配伍肉豆蔻、核桃仁对L02细胞损伤作用的差异。结果:体内急性毒性研究显示,补骨脂、补骨脂+肉豆蔻和补骨脂+核桃仁配伍水煎液对正常小鼠均有急性毒性作用,补骨脂水煎液LD50值与95%可信限为56.028g·kg-1·d-1(54.074～58.067 g·kg-1·d-1),相当于临床70 kg人日用量的392.2倍,补骨脂+肉豆蔻和补骨脂+核桃仁配伍水煎液MTD值按补骨脂含量计算分别为59.04g·kg-1·d-1和72.0 g·kg-1·d-1,分别相当于临床70 kg人日用量的413.28和504.0倍。急性毒性强度为:补骨脂水煎液>补骨脂+肉豆蔻配伍水煎液>补骨脂+核桃仁配伍水煎液,小鼠急性毒性症状主要有精神不佳、怠动、俯卧昏睡、抽搐、走路不稳。体内“时-毒”关系研究显示,小鼠单次灌胃11.21 g·kg-1补骨脂水煎液后0.5 h血清ALT、AST水平开始升高,在药后6 h达到高峰,与正常组相比,药后2 h～72 h血清ALT、AST水平极显著性升高（P<0.001）,药后2～24 h肝脏系数升高（P<0.05）,并在药后6 h（P<0.001）达到峰值,肝组织病理形态学检查显示药后8 h后可对肝组织产生明显损伤;小鼠单次灌胃44.28 g·kg-1补骨脂+肉豆蔻配伍水煎液后0.5 h血清ALT、AST水平开始升高,在药后8 h达到高峰,与正常组相比,药后2 h～72 h血清ALT、AST水平极显著性升高（P<0.001）,药后2～24 h组肝脏系数升高（P<0.05）,并在药后8h（P<0.001）达到峰值,肝组织病理形态学检查未见异常;小鼠单次灌胃58.50 g·kg-1补骨脂+核桃仁配伍水煎液后1 h血清ALT、AST水平开始升高,分别在药后8 h、12h达到高峰,与正常组相比,药后2 h～72 h血清ALT、AST水平极显着性升高（P<0.001）,药后2～24 h肝脏系数升高（P<0.05）,并在药后8 h（P<0.001）达到峰值,肝组织病理形态学检查未见异常。体内“量-毒”关系研究显示,与正常组相比,补骨脂水煎液6.29～11.21 g·kg-1组ALT水平及9.25～11.21 g·kg-1组AST水平极显著性升高（P<0.001）,血清ALT、AST水平呈剂量-效应关系,9.25～11.21 g·kg-1组肝脏系数升高（P<0.05）,11.21 g·kg-1组小鼠肝组织病理形态学检查可见肝细胞坏死及炎性细胞浸润灶,肝细胞索排列紊乱及少量炎性细胞浸润;与正常组相比,补骨脂+肉豆蔻配伍水煎液15.04～44.28 g·kg-1组ALT水平及25.81～44.28 g·kg-1组AST水平极显著性升高（P<0.001）,血清ALT、AST水平呈剂量-效应关系,44.28 g·kg-1组肝脏系数升高（P<0.05）,各组小鼠肝组织病理形态学检查未见异常;与正常组相比,补骨脂+核桃仁配伍水煎液31.0～58.50 g·kg-1组ALT水平极显著性升高（P<0.001）,AST水平显著性升高（P<0.01）,血清ALT、AST水平呈剂量-效应关系,58.50 g·kg-1组肝脏系数升高（P<0.05）,各组小鼠肝组织病理形态学检查未见异常。补骨脂水煎液致小鼠肝毒性损伤的剂量范围是6.29～11.21 g·kg-1,相当于70kg人日用量的44.03～78.47倍。补骨脂+肉豆蔻和补骨脂+核桃仁配伍水煎液致小鼠肝毒性损伤的剂量范围按补骨脂含量计算分别是10.03～29.52 g·kg-1和19.08～36 g·kg-1,相当于70 kg人日用量的70.21～206.64倍和133.56～252.0倍。体外离体肝脏灌流研究显示,与0min相比,0.9和3.6 g·kg-1组补骨脂水煎液大鼠离体肝脏灌流液ALT水平在75～120min显著性升高（P<0.01）,7.2 g·kg-1组ALT水平在45～120 min显著性升高（P<0.01）。0.9 g·kg-1组补骨脂水煎液大鼠离体肝脏灌流液AST水平在75～120 min升高（P<0.05）,3.6 g·kg-1组AST水平在75～120 min显著性升高（P<0.01）,7.2 g·kg-1组AST水平在60～120 min显著性升高（P<0.01）。与0 min相比,1.35 g·kg-1组补骨脂+肉豆蔻配伍水煎液大鼠离体肝脏灌流液ALT水平在120 min显著性升高（P<0.01）,5.40 g·kg-1组ALT水平在90～120 min显著性升高（P<0.01）,10.80 g·kg-1组ALT水平在75～120 min显著性升高（P<0.01）。1.35 g·kg-1组补骨脂+肉豆蔻配伍水煎液大鼠离体肝脏灌流液AST水平在120 min升高（P<0.05）,5.40 g·kg-1组AST水平在90～120 min显著性升高（P<0.01）,10.80 g·kg-1组AST水平在60～120 min显著性升高（P<0.01）。与0 min相比,5.84 g·kg-1组补骨脂+核桃仁配伍水煎液大鼠离体肝脏灌流液ALT、AST水平在90～120 min升高（P<0.05）,11.68 g·kg-1组ALT、AST水平在90～120 min显著性升高（P<0.01）。灌流液中ALT、AST酶活性具有明显的剂量-效应和时间-效应关系。体外L02细胞影响研究显示,补骨脂、补骨脂+肉豆蔻和补骨脂+核桃仁配伍水煎液作用于L02细胞24 h后,半数抑制浓度(IC50)分别为11.07、18.35和27.23 mg·L-1。随着浓度的增加,补骨脂、补骨脂+肉豆蔻和补骨脂+核桃仁配伍水煎液对L02细胞的损伤均增大,同浓度下补骨脂+肉豆蔻和补骨脂+核桃仁配伍水煎液对L02细胞增殖的抑制作用均低于补骨脂水煎液,药物组各剂量组与正常组比较均有极显著差异性（P<0.001）。对生化指标的影响显示,与正常组比较,补骨脂水煎液2.5～40 mg·L-1组ALT水平极显著性升高（P<0.001）,5～40 mg·L-1组细胞上清液AST、LDH水平极显著性升高（P<0.001）;与正常组比较,补骨脂+肉豆蔻配伍水煎液5～40 mg·L-1组细胞上清液ALT水平极显著性升高（P<0.001）,20～40 mg·L-1组细胞上清液AST、LDH水平显著性升高（P<0.01）;与正常组比较,补骨脂+核桃仁配伍水煎液20～40 mg·L-1组细胞上清液ALT水平极显著性升高（P<0.001）,AST、LDH水平显著性升高（P<0.01）。补骨脂、补骨脂+肉豆蔻和补骨脂+核桃仁配伍水煎液均能抑制L02细胞的生长增殖,对L02细胞产生毒性作用,且细胞毒性作用与剂量呈正相关,细胞毒性作用强度为:补骨脂水煎液>补骨脂+肉豆蔻配伍水煎液>补骨脂+核桃仁配伍水煎液。结论:综合体内外实验研究,提示按照一定比例配伍核桃仁、肉豆蔻均能降低补骨脂的肝毒性效应,改善补骨脂所致肝损伤,配伍核桃仁对补骨脂肝毒性的降低作用更为明显。为指导补骨脂临床合理用药提供实验依据。