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目的研究去甲斑蝥素(NCTD)对体外培养的人肾小球系膜细胞(HMC)增殖和凋亡的影响,初步探讨其机制,为NCTD应用于慢性肾脏病的防治提供新的实验证据。方法1.MTT实验:通过检测梯度浓度胎牛血清(FBS)对HMCs增殖的影响,确定促HMCs增殖效果最佳的时间及浓度;2.Hoechest 33258实验:通过观察荧光显微镜下HMCs的细胞形态学变化,探究NCTD作用不同时间对HMCs凋亡的影响;3.JC-1荧光探针染色实验:通过荧光显微镜与流式细胞术检测NCTD作用12h后HMCs中JC-1聚合物/JC-1单体的值,确定HMCs线粒体膜电位的变化;4.ELISA实验:通过ELISA实验检测NCTD作用12h后HMCs胞浆Cyt-C的表达,初步探讨HMCs凋亡的通路。结果1.MTT实验显示FBS诱导HMCs增殖与浓度和时间相关,以25%FBS与30%FBS处理12h后细胞活力较佳,其增值率分别为61.13±4.73)%及(68.10±9.15)%,与空白对照组相比差异有显著性(P<0.01),选择25%FBS进行后续实验。NCTD对25%FBS诱导的HMCs的增殖呈抑制作用,其抑制率呈时间—剂量依赖关系(P<0.05)。半数抑制浓度(IC50)随着NCTD作用时间的延长逐渐降低,非线性拟合计算24h的IC50为10.03ug/ml,48h的IC50为7.58ug/ml;2.Hoechest 33258实验显示对照组及增殖组细胞核均质、大小匀称,NCTD干预后各实验组不同程度地核浓集,或边集、呈碎片状,出现凋亡小体。2.5ug/ml NCTD干预HMCs 6h、12h、24h后凋亡率分别为(4.63±1.55)%,(5.22±2.27)%和(10.55±3.41)%,与对照组及增殖组比较均有统计学意义(P<0.05);5ug/ml NCTD干预HMCs 6h、12h、24h后凋亡率分别为(15.61±4.67)%,(18.13±2.78)%,(31.51±7.64)%,与对照组(1.49±0.47)%及增殖组(1.39±0.85)%比较均有统计学意义(P<0.05);10ug/ml NCTD干预HMCs 6h、12h、24h后凋亡率分别为(33.24±13.15)%、(45.53±6.24)%、(78.92±11.12)%,与对照组(5.48±3.24)%及增殖组(8.12±10.55)%比较均有统计学意义(P<0.05)。说明NCTD可诱导HMCs凋亡,其凋亡率具有时间-剂量依赖的特点;3.JC-1荧光探针染色实验显示NCTD作用12h后,与对照组及增殖组相比,HMCs线粒体膜电位随NCTD暴露浓度的升高显著下降,流式细胞术检测HMCs的线粒体膜电位改变结果示与对照组(1.71±0.25)相比,各实验组细胞JC-1聚合物/JC-1单体的值呈浓度依赖性显著降低(0.47±0.14、0.37±0.19、0.22±0.11、0.14±0.04),具有统计学差异(P<0.05),但各实验组组间差异并不显著(P>0.05);4.Cyt-C ELISA酶联免疫吸附实验提示,与对照组及增殖组相比,NCTD作用于HMCs 12h后能显著增加细胞色素C的释放量,2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml 4个不同浓度的加药组细胞色素C的浓度分别为(15.95±0.29,17.96±0.28,43.98±2.10,56.07±2.35)ng/ml,与增殖组(0.99±1.40)相比差异均具有统计学意义(P<0.05),与对照组(11.35±6.22)相比,2.5μg/ml、5μg/ml剂量的NCTD加药组差异无统计学意义,10μg/ml、20μg/ml剂量的NCTD加药组组间差异统计学意义显著(P<0.05)。这提示了NCTD或通过破坏线粒体通透性,使细胞色素C释放到细胞胞浆中,诱导了HMC细胞的凋亡。结论1.高浓度FBS诱导HMCs呈浓度-时间依赖性显著增殖,以25%FBS干预12h为佳;2.一定的时间和浓度范围内,NCTD可抑制HMCs增殖并诱导其凋亡,呈现明显的时间-剂量依赖性,说明NCTD对高浓度FBS诱导的HMCs有明显的抑增殖和促凋亡作用;3.NCTD可通过降低HMCs线粒体膜电位并使Cyt-C释放至胞质中启动HMCs的凋亡程序,最终诱导其凋亡。