第一部分:表皮树突状T淋巴细胞对创面修复的影响研究背景皮肤是人体最表层的屏障,发挥着抵抗外界损伤的作用。在临床上,创伤、烧伤、慢性难愈合创面等都是常见的皮肤损伤,如何有效地、及时地封闭创面对于病人来说至关重要。皮肤的创面愈合是一个多种因素影响的、多种细胞参与的复杂过程。表皮树突状T淋巴细胞(DETC)属于γδT淋巴细胞,是小鼠表皮内主要的淋巴细胞类型,在创面愈合当中能够迁移到创面,通过多种机制促进创面愈合。目前,大量的研究表明了DETC在促进创面愈合当中的重要作用,包括了分泌可溶性细胞因子、募集炎症细胞、分泌炎症因子、调节表皮细胞功能等。然而,创面过度的炎症反应对创面愈合是不利的,有必要进一步验证DETC对创面愈合的作用。研究目的验证DETC对皮肤创面愈合的影响。研究方法1.探究DETC缺失对于创面愈合的影响。构建野生型小鼠和Tcrδ基因敲除小鼠(DETC缺失)皮肤创面愈合模型(背部皮肤打孔),观察并比较两组小鼠未愈合创面的百分比。通过HE染色比较两组小鼠新生上皮长度。通过Western blotting比较创缘表皮的PCNA表达情况。2.探究DETC重建对于创面愈合的影响。构建Tcrδ基因敲除小鼠对照组及Tcrδ基因敲除小鼠+DETC实验组的皮肤创面愈合模型,观察并比较两组小鼠未愈合创面的百分比。通过HE染色比较两组小鼠新生上皮长度。通过Western Blot比较创缘表皮细胞的PCNA表达情况。结果1.DETC缺失使创面愈合延迟,创缘表皮细胞增殖延缓。与野生型对照组小鼠相比,Tcrδ基因敲除组创面愈合速度明显减慢。Tcrδ基因敲除组小鼠伤后3 d创面新生上皮长度为359±15(μm),短于野生型对照组小鼠的462±26(μm)(P<0.001)。Tcrδ基因敲除组小鼠创缘表皮细胞的PCNA/GAPDH比值为1.25±0.04,低于野生型对照组小鼠的2.01±0.09(P<0.01)。2.创缘加入DETC能够促进创面愈合,创缘表皮细胞增殖加速。与Tcrδ基因敲除对照组比较,Tcrδ基因敲除+DETC组小鼠创面愈合速度加快。Tcrδ基因敲除+DETC组小鼠伤后3 d新生上皮长度为465±31(μm),长于Tcrδ基因敲除对照组小鼠的375±21(μm)(P<0.05)。Tcrδ基因敲除+DETC组小鼠创缘表皮细胞的PCNA/GAPDH比值为1.62±0.08,高于Tcrδ基因敲除对照组小鼠创缘表皮细胞的1.05±0.14(P<0.05)。结论DETC能够促进创面愈合,部分通过促进创缘表皮细胞增殖而加速创面再上皮化。第二部分:表皮树突状T淋巴细胞对创面表皮干细胞的影响研究背景ESC是表皮基底层的幼稚细胞,在正常皮肤当中处于相对静息状态,通过增殖、分化维持表皮细胞的更新。在皮肤损伤情况下,ESC能够分裂增殖,促进创面愈合,创缘ESC在创面再上皮化的过程中起着至关重要的作用。目前的研究表明了DETC在创面愈合当中的重要作用,而ESC的分裂增殖是创面愈合的基础,但是DETC是否参与了这一过程目前尚无深入研究。我们此前的体外实验结果表明DETC能够通过分泌IGF-1促进ESC的干性维持,减弱其向终末细胞的分化,同时还能够促进ESC的增殖活性。然而相关的结果缺乏体内学实验证据,有必要进一步研究DETC是否调节ESC细胞而影响创面愈合。研究目的在体内学实验基础上研究DETC对创面ESC数量的影响。研究方法1.探究DETC缺失对正常表皮内ESC数量的影响。使用野生型小鼠和Tcrδ基因敲除小鼠正常皮肤。通过流式细胞术比较两组正常表皮内CD49~+CD71~-ESC和K15~+ESC比例差异。通过免疫荧光法比较两组正常表皮内K15~+ESC的数量差异。2.探究DETC缺失对于创缘ESC数量的影响。构建野生型小鼠和Tcrδ基因敲除小鼠皮肤创面愈合模型。通过流式细胞术比较两组创缘CD49~+CD71~-ESC和K15~+ESC比例差异。通过免疫荧光方法比较两组创缘K15~+ESC的数量差异。3.探究DETC重建对于创缘ESC数量的影响。构建Tcrδ基因敲除小鼠对照组及Tcrδ基因敲除小鼠+DETC实验组的皮肤创面愈合模型。通过流式细胞术比较两组创缘CD49~+CD71~-ESC和K15~+ESC比例差异。通过免疫荧光方法比较两组创缘K15~+ESC的数量差异。结果1.DETC缺失不影响正常表皮内ESC数量。通过流式细胞术,发现在正常皮肤当中,DETC缺失不影响CD49~+CD71~-ESC以及K15~+ESC比例(P>0.05,P>0.05)。通过激光共聚焦,发现野生型小鼠和Tcrδ基因敲除小鼠正常皮肤当中K15~+ESC数量差异无统计学意义(P>0.05)。2.DETC缺失使得创缘表皮内ESC数量减少。通过流式细胞术,发现相比野生型小鼠,损伤状态下Tcrδ基因敲除小鼠创缘表皮内CD49~+CD71~-ESC以及K15~+ESC比例减少(P<0.001,P<0.001)。通过激光共聚焦,发现相较于野生型小鼠,Tcrδ基因敲除小鼠创缘表皮中当中K15~+ESC数量减少(P<0.001)。3.DETC加入Tcrδ基因敲除小鼠的创缘能够增加其创缘表皮内ESC数量。通过流式细胞术,发现在创缘皮肤当中,外源性给与DETC能够增加Tcrδ基因敲除小鼠创缘CD49~+CD71~-ESC和K15~+ESC的比例(P<0.001,P<0.01)。通过激光共聚焦,发现外源性给予DETC能够增加Tcrδ基因敲除小鼠创缘K15~+ESC的数量(P<0.01)。结论DETC不影响正常表皮内ESC数量,但是能够增加创缘表皮内ESC数量。第三部分:表皮树突状T淋巴细胞通过外泌体促进表皮干细胞干性维持和增殖研究背景ESC是创面再上皮化的母细胞,创缘ESC数量决定了创面再上皮化的速度。而创缘ESC数量取决于ESC的干性维持能力和增殖速度。在皮肤损伤情况下,ESC能够分裂增殖,促进创面愈合,但是ESC增殖的过程伴随着干性维持能力减弱、增殖能力减弱。我们此前的研究结果表明DETC能够通过分泌IGF-1促进ESC的干性维持和增殖,减弱其向终末细胞的分化,然而,游离的IGF-1作用仍然较弱,无法完全解释DETC促进ESC干性维持以及增殖的效应。外泌体是一种高效的细胞间信号沟通的渠道,比游离的细胞因子更有活性,众多的免疫细胞都能够分泌外泌体。DETC作为表皮内重要的免疫细胞,尚无外泌体相关研究,有必要进行进一步的实验明确DETC发挥作用是否通过了更高效的外泌体途径。研究目的通过体外研究明确DETC促进ESC干性维持和增殖的机制。研究方法1.探究DETC能否分泌外泌体。提取DETC分泌的外泌体,使用Western blotting检测外泌体标志蛋白表达,透射电镜观察外泌体形态,纳米粒度仪分泌外泌体直径。2.探究DETC是否通过分泌外泌体对ESC的干性维持和增殖产生影响。培养ESC,使用Transwell小室将ESC隔离在下层,分别向上层加入普通DETC及外泌体分泌抑制剂处理后的DETC作为实验组,单纯培养的ESC作为对照组,共培养一定时间后,通过流式细胞术比较三组ESC的比例差异。将ESC进行CFSE染色后,分别加入上述处理因素,通过流式细胞术比较三组ESC增殖的差异。3.探究DETC分泌的外泌体是否能够对ESC的干性维持和增殖产生影响。使用DETC分泌的外泌体处理ESC作为实验组,不加外泌体作为对照组,通过流式细胞术比较ESC的比例差异。将ESC进行CFSE染色后,分别加入上述处理因素,通过流式细胞术比较组间ESC增殖的差别。结果1.DETC能够分泌大量外泌体。通过Western blotting,发现DETC分泌的外泌体表达CD63和TSG101蛋白,不表达Canexin蛋白。透射电镜观察可见DETC外泌体为椭圆形囊泡样,外层为完整的膜结构,中心为低密度区。粒径分析表明,DETC外泌体直径分布于50-140nm。2.DETC通过分泌外泌体促进ESC干性维持。(1)ESC高密度接种时。对照组CD49~+CD71~-ESC比例为54.66±1.34(%),DETC共培养组的ESC的比例为74.02±2.12(%),高于对照组,差异有统计学意义(P<0.001)。使用外泌体抑制剂处理后的DETC与ESC共培养,CD49~+CD71~-ESC比例为62.88±1.70(%),低于正常DETC共培养组,差异有统计学意义(P<0.01)。对照组K15~+ESC比例为58.70±0.90(%),DETC共培养组的K15~+ESC的比例为73.38±2.14(%),高于对照组,差异有统计学意义(P<0.001)。此外,使用外泌体抑制剂处理后的DETC与ESC共培养,K15~+ESC比例为62.58±2.71(%),低于正常DETC共培养组,差异有统计学意义(P<0.05)。(2)ESC低密度接种时。对照组的CD49~+CD71~-ESC比例为16.78±0.93(%),DETC共培养组的CD49~+CD71~-ESC的比例为53.46±1.41(%),高于对照组,差异有统计学意义(P<0.001)。此外,使用外泌体抑制剂处理后的DETC与ESC共培养,CD49~+CD71~-ESC比例为28.02±1.42(%),低于正常DETC共培养组,差异有统计学意义(P<0.001)。对照组的K15~+ESC比例为16.78±0.93(%),DETC共培养组的K15~+ESC的比例为48.74±1.92(%),高于对照组,差异有统计学意义(P<0.001)。此外,使用外泌体抑制剂处理后的DETC与ESC共培养,K15~+ESC比例为38.46±0.96(%),低于正常DETC共培养组,差异有统计学意义(P<0.01)。3.DETC分泌的外泌体促进ESC干性维持。对照组、5μg/ml外泌体处理组、15μg/ml外泌体处理组、45μg/ml外泌体处理组的CD49~+CD71~-ESC比例分别为15.62±1.17(%)、33.18±1.92(%)、46.62±1.50(%)、48.46±2.79(%),三组实验组相比对照组的差异均存在统计学意义(P<0.001,P<0.001,P<0.001)。对照组、5μg/ml外泌体处理组、15μg/ml外泌体处理组、45μg/ml外泌体处理组的K15~+ESC比例分别为21.24±0.98(%)、29.82±1.56(%)、42.20±1.93(%)、46.58±2.30(%),相比对照组,实验组差异均存在统计学意义(P<0.01,P<0.001,P<0.001)。4.DETC通过外泌体途径促进ESC增殖。对照组发生增殖的ESC(CFSE~-ESC)比例为10.08±0.75(%),DETC组的CFSE~-ESC比例为58.58±1.65(%),高于对照组,差异有统计学意义(P<0.001)。此外,使用外泌体抑制剂后的DETC与ESC共培养,CFSE~-ESC比例为24.74±0.96(%),低于普通DETC共培养组,差异有统计学意义(P<0.001)。5.DETC分泌的外泌体促进ESC增殖。对照组、5μg/ml外泌体处理组、15μg/ml外泌体处理组、45μg/ml外泌体处理组的CFSE~-ESC比例比例分别为14.66±1.13(%)、31.88±0.75(%)、43.70±1.70(%)、48.62±2.13(%),实验组相比对照组,差异均存在统计学意义(P<0.001,P<0.001,P<0.001)。结论DETC可以通过外泌体调节ESC细胞的干性维持和增殖,并最终促进皮肤创面的修复。