1.研究背景乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)感染是引起肝硬化和肝癌等疾病的主要因素。目前用于治疗乙肝的药物主要是干扰素(Interferon,IFN)和核苷(酸)类药物等。干扰素通过诱导产生抗病毒蛋白质和调节免疫治疗乙肝,但其副作用大,且单一使用时,反应率低,只有30%,无法完全清除病毒。核苷(酸)类药物主要有拉米夫定、恩替卡韦、阿德福韦等,此类药物可抑制HBV-DNA逆转录酶活性,但患者易产生耐药性,且停药后易发生反跳现象。因此寻找高效低毒的抗HBV药物依然是医药工作者孜孜不倦追寻的目标。天然产物是先导化合物的重要来源,也是发现新药的最有效途径之一。据统计,在1981-2010年间上市的1355种药物中,来源于天然产物的占39%,其中4%直接来源于天然产物,35%是天然产物经结构修饰后的衍生物。究其原因,主要是因为部分天然产物存在活性不够强,作用特异性低,药代动力学性质不理想或毒副作用大等不足,因此需要做进一步的结构改造或修饰以增加其成药性。我们课题组前期对民间草药蔓茎堇菜(Viola diffusa Ging)进行了化学成分及抗HBV活性的研究,从其95%乙醇提取物中分离得到的5个木栓烷型五环三萜化合物中,3个是A环具有3,4-裂-七元内酯结构的新化合物,且表现出明显的对HepG2.2.15细胞分泌HBeAg、HBsAg的抑制作用,而不含此结构的其他五环三萜化合物则作用较弱或无作用。因此推测:A环的3,4-裂-七元内酯结构可能是五环三萜类化合物抗HBV活性的重要药效结构单元。齐墩果酸(Oleanic acid,OA)、熊果酸(Ursolic acid,UA)、白桦脂酸(Betulinic acid,BA)、木栓酮(friedelin)等都是在天然产物中分布较为广泛的五环三萜化合物,具有多种多样的生理活性,特别是在抗病毒活性方面。如齐墩果酸(EC5o=1.7mg/ml)、白桦脂酸(ED5o=1.7mg/ml)可抑制急性感染了H9细胞的HIV-1的复制,并同时抑制H9细胞的生长(IC5o=21.8mg/ml、13μmol/L)。熊果酸有抗HIV-1蛋白酶、人乳头瘤病毒和A型流感病毒等活性。木栓酮具有抗胃溃疡、抗炎、镇痛等活性。近年来,通过对这些先导化合物的结构修饰,已筛选出一些高效低毒的化合物。鉴于此,本论文拟以具有生物活性的五环三萜化合物齐墩果酸(OA)、熊果酸(UA)、木栓酮(friedelin)、白桦脂酸(BA)等为原料,对其A环进行结构改造,设计并合成一系列A环具有3,4-裂-七元内酯结构的五环三萜内酯化合物,通过比较内酯化合物水解前后对HepG2.2.15细胞毒的作用,探讨3,4-裂-七元内酯结构在五环三萜化合物抗乙肝病毒活性中的地位及作用。2.目的在前期研究发现3,4-裂-七元内酯结构可能是五环三萜抗HBV活性的药效基团的基础上,本文对天然来源的活性丰富的五环三萜化合物OA、UA、BA及木栓酮等的A环进行结构修饰,制备具有3,4-裂-七元内酯结构的五环三萜化合物,并将各内酯进行水解,通过比较水解前的内酯及水解后的水解产物对HepG2.2.15细胞毒的作用,明确A环的3,4-裂-七元内酯结构是否为五环三萜化合物抗HBV活性的药效基团或结构单元,为设计、寻找具有抗乙型肝炎病毒活性的先导化合物提供实验依据。3.方法3.1 3-氧代五环三萜的合成:以齐墩果酸、熊果酸、白桦脂酸为原料,室温下采用Jones试剂合成3-氧代-齐墩果酸(OA-1),3-氧代-熊果酸(UA-1),3-氧代-白桦脂酸(BA-1)。3.2 3,4-裂-五环三萜-3,4-内酯的合成:以OA-1、UA-1、木栓酮为原料,in-CP8为氧化剂,采采用Baeyer-Villiger氧化重排反应,合成3,4-裂-五环三 萜-3,4-内酯。3.3 3,4-裂-五环三萜-3,4-内酯的水解:采用碱水解得方法,在5%氢氧化钾-甲醇条件下,制备3,4-裂-五环三萜-3,4-内酯的水解产物。3.4齐墩果酸衍生物的合成:以OA-1为原料,碳酸钾、溴化苄为反应试剂,在 DMF 中 55℃ 进行反应,合成 3-oxo-olean-12-en-28-oic acid benzyl ester(OA-2-3)。以OA-2-3为原料,m-CPBA为氧化剂,合成3,12-dioxo-olean-12-en-28-oic acid benzyl ester(OA-2-4)。以 OA-1 为原料,在含0.05%硫酸(W/V)下与 m-CPBA 反应,合成 2α-hydroxy-3-oxo-olean-12-en-28-oic acid(OA-4)。3.5结构确定:通过现代波谱学技术手段(1H-NMR,13C-NMR,DEPT,HMBC,HMQC,ESI-MS)对得到的各化合物进行结构鉴定。3.6对HepG2.2.15细胞存活率的影响:将合成的化合物(除了中间体)和反应原料齐墩果酸、熊果酸、木栓酮分别配制成6个药物浓度梯度,实验组:加入不同浓度的含药培养液;空白对照组:加入完全培养基(无细胞);DMSO对照组:加入含1%DMSO的完全培养基,每组各设置6个复孔,采用MTT法,观察各化合物对HepG2.2.15细胞存活率的影响,并计算半数毒性浓度(TC50)。采用SPSS 13.0软件对数据进行统计学分析,判断组间差异是否有统计学意义。4.结果4.1本文以齐墩果酸、熊果酸、木栓酮、白桦脂酸为原料,合成了 4个A环为七元内酯结构的3,4-裂-五环三萜-3,4-内酯:3,4-seco-olean-12α-hydroxy-28,13β-olide-3,4-lactone(OA-2-lBV)、11-oxo-3,4-seco-olean-12-en-28-oic acid-3,4-lactone(OA-2-2BV)、3,4-seco-ursan-12-en-28-oic acid-3,4-lactone(UA-2)、3,4-seco-friedelin-3,4-lactone(F-l);2 个内酯的水解产物4,12α-dihydroxy-3-carboxy-olean-28,13β-olide(OA-3-1),(OA-3-1),4-hydroxy-ursan-12-en-3,28-dioic acid(UA-3);3 个齐墩果酸衍生物:3-oxo-olean-l 2-en-28-oic acid benzyl ester(OA-2-3)、3,12-dioxo-olean-12-en-28-oic acid benzyl ester(OA-2-4)、2α-hydroxy-3-oxo-olean-12-en-28-oic acid(OA-4),以及 5 个中间体:3-oxo-olean-12-en-28-oic acid(OA-1)、3-oxo-12α-hydroxy-olean-28,13β-olide(OA-2-1)、3,1 1-oxo-olean-12-en-28-oic acid(OA-2-2)、3-oxo-ursan-12-en-28-oic acid(UA-1)、3-oxo-lup-20(29)-en-28-oic acid(BA-1)。其中化合物11-oxo-3,4-,seco-olean-12-en-28-oic acid-3,4-lactone(OA-2-2BV)、3,12-dioxo-olean-12-en-28-oic acid benzyl ester(OA-2-4)为新化合物。以上各化合物的化学结构经1H-NMR、13C-NMR、DEPT、HMBC、HMQC、MS等现代波谱技术得到确证。4.2本文采用MTT法测定了反应原料OA、UA、木栓酮,3,4-裂-五环三萜内酯及其水解产物等对HepG2.2.15细胞存活率的影响。(1)3,4-裂-齐墩果酸-3,4-内酯及其衍生物对HepG2.2.15细胞存活率的影响:从细胞存活率来看,各实验组随药物浓度的增加,细胞存活率呈现降低的趋势,其中化合物OA-2-2BV、OA-4在浓度为50μmol/L时,细胞存活率分别为 62.9%、60.6%;而化合物 OA、OA-2-1BV、OA-3-1、OA-2-3、OA-2-4 在所测浓度范围内,细胞存活率几乎均在90%以上。反应原料OA(TC5o=8494.0μmol/L)经Baeyer-Villiger氧化重排反应得到的3,4-裂-齐墩果酸内酯,OA-2-lBV、OA-2-2BV 的半数毒性浓度 TC50 值分别为 182.0、68.1μmol/L;与反应原料相比,生成的3,4-裂七元内酯对HepG2.2.15细胞毒的作用明显增加,OA-2-1BV增加了约47倍,OA-2-2BV增加了约125倍。OA-2-1BV的七元内酯经碱水解开环后,得到的水解产物OA-3-1的TC50为281.0μmol/L,与水解前的内酯相比,对HepG2.2.15细胞毒的作用有所降低(约1.6倍)。通过比较反应原料OA、3,4-裂-齐墩果酸内酯OA-2-1BV以及内酯的水解产物OA-3-1的细胞存活率及TC5o值,可以看出3,4-裂-齐墩果酸-3,4-内酯中A环的七元内酯结构对HepG2.2.15细胞毒的作用影响较显著。反应原料OA(TC5o=8494.Oμmol/L)的C-3羟基被氧化成酮羰基,分别在C-2位引入α-OH、C-28位引入苄基,得到的齐墩果酸衍生物OA-4、OA-2-3的TC5o值分别为82.0μmol/L、2955.Oμmol/L,与反应原料OA相比,对HepG2.2.15细胞毒的作用都有增加,以OA-4最为明显。将OA-2-3的C12位双键氧化后,得到的齐墩果酸衍生物OA-2-4,其TC50值为735.9μmol/L,与双键氧化前相比,对HepG2.2.15细胞毒的作用也有增加。(2)3,4-裂-熊果酸-3,4-内酯及其衍生物对HepG2.2.15细胞存活率的影响:反应原料UA在200μmol/L时,细胞存活率达到98.9%,TC50为3572.0μmol/L。当UA经Baeyer-Villiger氧化重排生成3,4-裂-熊果酸内酯UA-2时,TC50值为54.1μmol/L,50μmol/L时的细胞存活率为51.8%。与反应原料UA相比,UA-2对HepG2.2.15细胞毒的作用明显增加(约66倍)。UA-2的七元内酯经碱水解开环后,得到的水解产物UA-3的TC50为613.7μmol/L,与水解前的内酯相比,对HepG2.2.15细胞毒的作用明显降低(11.3倍),50μmol/L时的细胞存活率为74.7%。通过比较反应原料UA、3,4-裂-熊果酸-3,4-内酯UA-2以及内酯的水解产物UA-3细胞存活率及TC5o值,可以看出3,4-裂-熊果酸内酯中A环的七元内酯结构对HepG2.2.15细胞毒的作用影响较显著。(3)3,4-裂-木栓酮-3,4-内酯及木栓酮对HepG2.2.15细胞存活率的影响:反应原料木栓酮在所测浓度范围内(3.125-50μmol/L),细胞存活率可达94.5%以上,TC5o值为2352.0μmol/L。当木栓酮经Baeyer-Villiger氧化重排生成3,4-裂-木栓烷-3,4-内酯F-1时,细胞存活率略有下降为90.4%,TC5o值为563.3μmol/L,与木栓酮相比,对HepG2.2.15细胞毒的作用增加了 4倍多。5.结论5.1本文以齐墩果酸、熊果酸、木栓酮、白桦脂酸等五环三萜化合物为原料,合成了 14个3,4-裂-五环三萜-3,4-内酯及其衍生物,其中2个化合物为未见文献报导的新化合物,各化合物结构经1H-NMR、13C-NMR、MS等现代波谱技术得到确证。5.2各化合物随药物浓度的增加,HepG2.2.15细胞存活率呈现逐渐降低的趋势。在五环三萜的A环引入七元内酯结构能明显增加对HepG2.2.15细胞毒的作用,而内酯结构水解开环即内酯结构消失后,对HepG2.2.15细胞毒的作用也随之降低。说明3,4-裂-五环三萜-3,4-内酯中A环的七元内酯结构是影响HepG2.2.15细胞毒作用的重要药效基团。齐墩果酸衍生物对HepG2.2.15的细胞毒作用的研究结果提示,齐墩果酸的C-2位、C-12位、C-28位可能是提高其生物活性的良好修饰位点。