研究背景细胞凋亡受阻在肿瘤的发生、发展过程中发挥着重要作用。在多细胞的有机体中,细胞增殖和凋亡之间存在着动态平衡,当平衡被打破,则可能导致肿瘤的发生。Caspases （Cysteine aspartate-specific proteases天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶）家族是凋亡的执行者,凋亡调控蛋白可直接或间接通过调节caspases活性而改变细胞活性。细胞凋亡抑制因子家族（Inhibitor of Apoptosis Proteins, IAPs）是一类凋亡抑制蛋白家族,具有抑制细胞凋亡作用。XIAP （X-linked Inhibitor of Apoptosis）是IAP家族中抑制caspases活性作用最强、作用范围最广的一员,能够同时抑制caspases凋亡通路中的起始阶段和效应阶段。文献报道XIAP在黑色素瘤,直肠癌等多种恶性肿瘤中过度表达,且与肿瘤不良预后相关。XIAP在上皮性卵巢中表达与临床分期、细胞分级及生存期相关。抑制XIAP表达能增强肿瘤细胞如卵巢癌细胞对化疗药物的敏感性,抑制肿瘤细胞生长。体外实验证实降低XIAP表达能抑制裸鼠移植瘤生长。XAF1（XIAP Associated Factor1）是在2000年通过与XIAP的酵母双杂交发现的一个基因,可以直接结合XIAP并抑制其抗caspases的活性而诱导细胞凋亡。XIAP主要分布于细胞浆和细胞核周围区域,XAF1定位于细胞浆和细胞核内,XAF1表达可使XIAP重新分布,从胞浆移位到胞核内,从而阻断了对caspases的结合。文献报道XAF1在多种肿瘤中表达降低或缺失,并与临床及病理指标有一定相关性,如黑色素瘤、肝癌、胃癌及直肠癌等,表明XAF1与肿瘤的发生、发展相关,在卵巢癌中无相关文献报道。本研究选取进展期上皮性卵巢癌（Ⅱ-Ⅲ）（EOC）及卵巢囊腺瘤组织,采用免疫组化的方法检测促凋亡因子XAF1和凋亡抑制因子XIAP的表达,探讨两者表达与卵巢癌患者临床病理特征、预后及微血管密度（Microvessel Density, MVD）的关系。XAF1能抑制肝癌细胞的增殖并诱导其凋亡,增加肝癌细胞对5-氟尿嘧啶等化疗药物的敏感性。XAF1过度表达能诱导结肠肿瘤细胞凋亡,显著增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。顺铂（Cisplatin）是第一代的铂类抗肿瘤药物,具有广泛的抗肿瘤作用,其抗肿瘤的作用强且活性高,与其它抗肿瘤药物少有交叉耐药性。目前卵巢癌术后化疗首选紫杉醇加铂类药物,逐渐出现的化疗耐药已成为影响卵巢癌临床治疗效果的重要障碍。XAF1基因表达缺失的卵巢癌细胞SKOV3对顺铂具有天然的耐药性,本研究以SKOV3细胞为研究对象,通过基因转染技术,提高XAF1表达,观察其对细胞增殖、凋亡及对顺铂耐药性的影响,探讨其作用机制,为寻找卵巢癌治疗的新靶点提供理论依据。第一部分：XAF1和XIAP在卵巢癌组织中的表达及临床意义研究目的：检测促凋亡因子XAF1和凋亡抑制因子XIAP在上皮性卵巢肿瘤组织中的表达,探讨XAF1及XIAP的表达与患者临床病理特征、预后及MVD的关系。资料方法：选取山东大学齐鲁医院2003年9月至2008年12月手术切除的上皮性卵巢癌（Ⅱ-Ⅳ期）组织共94例、卵巢囊腺瘤组织30例,行免疫组化染色,检测XAF1和XIAP在EOC及卵巢囊腺瘤组织中的表达,行CD31抗体染色,检测组织中微血管密度（MVD）。收集患者完整的临床信息,包括患者的年龄、FIGO （Federation International of Gynecology and Obstetrics）分期、病理类型、细胞分级、是否存活等并对其进行统计分析。结果：1. XAF1和XIAP在卵巢肿瘤组织中的表达免疫组化结果显示XAF1在卵巢上皮细胞浆中表达,细胞核中几乎无表达,EOC细胞中XAF1表达强度及广度均低于卵巢囊腺瘤（3.35±2.54vs.5.63±2.72; p<0.001）。XIAP在卵巢上皮细胞胞浆中表达,卵巢囊腺瘤上皮细胞中XIAP着色强度及广度明显低于EOC细胞（2.13±2.11vs.3.87±2.46；p<0.001）。2. XAF1和XIAP在EOC组织中表达与临床病理参数的关系XAF1蛋白表达与卵巢癌细胞分级有关,高中分化细胞（G1、G2）中XAF1高表达率为54.3%（19/35）,低分化细胞（G3）中XAF1高表达率为30.5%（18/59）,差异有统计学意义（p<0.05）。FIGO分期为Ⅲ及Ⅳ期的卵巢癌患者中XAF1高表达率为33.8%（23/68）,低于Ⅱ期患者（53.8%,14/26）,但差异无统计学意义（p=0.099）。XIAP蛋白表达与患者年龄、FIGO分期、组织病理类型、淋巴结转移和细胞分级等临床病理参数无明显相关性。3. XAF1和XIAP在EOC组织中表达与组织微血管密度（MVD）的相关性分析EOC组织中MVD的中位值为12/HPF（3-31）（×400）, XAF1在EOC中蛋白表达与MVD密切相关,XAF1低表达组中MVD明显高于XAF1高表达组（15.46±7.48vs.10.95±5.33）,差异有统计学意义（p<0.01）。XIAP低表达组MVD低于XIAP高表达组（12.65±6.39vs.14.80±7.60）,但差异无统计学意义（p=0.141）。4. XAF1和XIAP在EOC组织中表达及MVD对患者预后的影响单因素生存分析显示XAF1高表达组中位生存时间明显长于XAF1低表达组,差异具有统计学意义（p=0.013）。XIAP低表达组中位生存时间长于高表达组,但差异无统计学意义（p=0.102）。低MVD组中位生存时间明显长于高MVD组,差异有统计学意义（p=0.027）。在其他单因素生存分析中,低分化者、Ⅲ-Ⅳ期患者中位生存期明显短于高中分化患者、Ⅱ期患者（p<0.05）。COX回归模型进行多因素分析结果显示,FIGO分期是进展期EOC的独立预后因素（p=0.041）,而XAF1、 XIAP表达、MVD及细胞分级均不是进展期EOC的独立预后因素。结论：1.EOC上皮细胞核及胞浆中XAF1表达较卵巢良性肿瘤降低而XIAP胞浆表达升高。2. XAF1表达与卵巢癌细胞恶性行为及患者预后相关。3. XAF1可能参与肿瘤新生血管形成。第二部分XAF1对SKOV3细胞生物学行为的影响及作用机制研究目的：通过基因工程技术上调卵巢癌细胞系SKOV3中XAF1的表达,检测XAF1对卵巢癌细胞SKOV3的生物学行为及对顺铂耐药性的影响,探讨XAF1在卵巢癌中的作用机制。研究方法：脂质体2000介导XAF1基因转染SKOV3细胞,G418筛选阳性克隆；Real-time RT-PCR及western blot鉴定稳定转染细胞中XAF1的表达；采用四甲基偶氮唑盐（3-（4,5-dimethylthiazol-2-yl）-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide, MTT）法检测转染后SKOV3细胞增殖；流式细胞术检测细胞凋亡率；Western blot法检测细胞相关凋亡蛋白的表达。结果：1.稳定表达XAF1基因的SKOV3细胞株的建立收集含重组质粒的菌液10ml,对重组XAF1质粒进行测序,结果显示该质粒与Homo sapiens XIAP associated factor1（XAF1）, transcript variant1mRNA （NCBI Reference Sequence:NM₀17523.2） CDS区100%匹配。经过4周G418筛选获得XAF1稳定表达的细胞株SKOV3/XAF1及空载体对照组SKOV3/Con。Real-time RT-PCR及western blot检测结果表明细胞SKOV3/XAF1中XAF1的mRNA及蛋白表达水平较SKOV3/Con显著增高。2. XAF1过表达对SKOV3细胞的生长抑制作用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测SKOV3/Con及SKOV3/XAF1的细胞增殖,结果显示,SKOV3/XAF1细胞增殖在培养的第2-4天较对照组明显减慢（p<0.05）,第1天两组细胞增殖无显著性差异（p>0.05）。3. XAF1过表达对SKOV3细胞凋亡的影响AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡,结果显示,SKOV3/XAF1细胞早期加晚期凋亡率较SKOV3/Con细胞明显增加（9.62±1.51%vs.5.44±1.11%）,差异有统计学意义（p<0.01）。4.顺铂对SKOV3细胞生长抑制及凋亡的影响四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测顺铂对SKOV3细胞的生长抑制作用,结果显示：顺铂作用48h后,0.1μM组SKOV3/Con及SKOV3/XAF1细胞的生长抑制率分别为11.6±2.30%和18.80±5.07%；1μM组SKOV3/Con及SKOV3/XAF1细胞生长抑制率分别为14.20±3.90%和25.00±4.06%；5μM组SKOV3/Con及SKOV3/XAF1细胞生长抑制率分别为19.60±1.82%和36.00±4.85%；10μM组SKOV3/Con及SKOV3/XAF1细胞生长抑制率分别为46.8±6.06%和61.20±3.27%。不同浓度的顺铂对SKOV3/XAF1组细胞的抑制率明显高于SKOV3/Con组（p<0.05；p<0.01）。5μM顺铂作用48h后SKOV3/XAF1细胞早期加晚期凋亡率明显高于SKOV3/Con细胞（37.75±5.85%vs.19.00±1.83%）（p<0.01）。5. XAF1过表达对SKOV3细胞内凋亡相关蛋白表达的影响将SKOV3/Con及SKOV3/XAF1细胞提取蛋白,行western blot检测相关凋亡蛋白的表达,结果显示,与SKOV3/Con相比,SKOV3/XAF1细胞中XIAP蛋白表达降低,胞浆中细胞色素C表达升高；caspase-3活性裂解片段p17和p11的表达量升高。结论：1. XAF1过表达能抑制卵巢癌细胞SKOV3增殖,促进其凋亡,提高SKOV3细胞对顺铂的敏感性。2. XAF1过表达通过下调XIAP表达,上调胞浆细胞色素C表达促进卵巢癌细胞凋亡。第三部分XAF1对SKOV3细胞裸鼠移植瘤生长的影响研究目的：建立裸鼠卵巢癌细胞移植瘤模型,将SKOV3/Con、SKOV3/XAF1两种卵巢癌细胞接种于裸鼠皮下,观察两组移植瘤生长情况,及两组裸鼠移植瘤组织MVD及相关凋亡蛋白的表达。研究方法：实验动物选用雌性BALB/c-nude裸鼠,鼠龄4-5周,在无菌SPF级的动物培养设备中饲养。30只裸鼠随机分为两组,对照组15只皮下注射SKOV3/Con细胞,实验组15只皮下注射SKOV3/XAF1细胞,建立裸鼠模型。荷瘤裸鼠接种细胞后,每日观察裸鼠的精神状况、皮肤、饮食、活动等,每周用游标卡尺测量肿瘤结节的长径（a）和短径（b）一次,并计算肿瘤体积,计算公式为V=a×b2×0.5,连续饲养6周后脱臼处死后剥除肿瘤称重。取下的瘤体部分用福尔马林固定,制作石蜡切片,行HE染色及免疫组化CD31染色。新鲜瘤体提取蛋白,western blot检测凋亡相关蛋白的表达。结果：1. XAF1过表达对SKOV3细胞裸鼠皮下移植瘤生长的的影响接种后裸鼠皮下形成的柔软皮丘慢慢吸收、逐渐消退。SKOV3/Con组裸鼠在第一周末开始出现可触及的瘤体,后生长迅速,在接种3周之后,裸鼠体重增长缓慢,后期体重下降,消瘦。SKOV3/XAF1组在第三周开始出现可触及瘤体且生长缓慢,裸鼠食欲较好,体重增长较快。六周后SKOV3/Con组15只裸鼠全部成瘤,SKOV3/XAF1组11只成瘤。脱臼处死裸鼠,剥除皮下移植瘤,测量长短径并称重,SKOV3/Con组肿瘤体积为1984±128.6mm3, SKOV3/XAF1组肿瘤体积为585.2±372.4mm3, SKOV3/Con组肿瘤体积明显大于SKOV3/XAF1组,差异有统计学意义（p<0.01）。SKOV3/Con组瘤体重1.82±0.14克,SKOV3/XAF1组瘤体重0.49±0.35克,SKOV3/Con组瘤重明显大于SKOV3/XAF1组,差异有统计学意义（p<0.01）。2. XAF1过表达对SKOV3细胞裸鼠移植瘤MVD的影响裸鼠移植瘤免疫组化染色结果显示：SKOV3/XAF1组MVD明显低于SKOV3/Con组（p<0.05）。3. XAF1过表达对SKOV3细胞裸鼠移植瘤凋亡相关蛋白表达水平的影响应用western blot检测裸鼠移植瘤相关凋亡蛋白的表达,结果显示：SKOV3/XAF1组XAF1蛋白表达较对照组升高,XIAP蛋白表达降低,胞浆cyto C蛋白表达增强,caspase-3活性片段表达增强。结论：1. XAF1过表达对SKOV3裸鼠移植瘤的生长具有抑制作用。2.在裸鼠体内XAF1过表达通过下调XIAP表达,上调胞浆细胞色素C表达促进卵巢癌细胞凋亡。