研究背景　　 骨质疏松症是以骨量减少、骨的微观结构退化为特征的，致使骨的脆性增加、易于发生骨折的一种全身性骨骼疾病。骨质疏松症常发生在绝经后妇女和老年人中。随着人口老龄化，罹患人数逐年增加。骨质疏松症已成为一个世界性的公共健康问题。骨是代谢活跃器官，正常状态下，骨形成和骨吸收处于一种动态的平衡。在生长发育期，骨的形成率和吸收率均较高，骨的更新代谢活跃;成年以后骨形成率和吸收率明显减少，骨的结构和成分处于稳定状态;随着年龄的增长或妇女在绝经期以后，骨形成不足同时伴有骨吸收增加，骨代谢平衡发生转换，造成骨量的减少和骨质强度的降低，最终导致骨质疏松等骨相关疾病的发生。　　 老年人中骨质疏松性骨折发病率的增高是与皮质骨和松质骨骨量进行性减少相关联的，特别是与骨形成的减少相关。近年来的研究表明，各种原因导致的骨量减少，如糖皮质激素应用、卵巢切除、长期制动等，常伴有骨髓中脂肪组织含量的增加。骨髓中脂肪组织不仅被动地为骨髓的造血功能保留一定空间，参与机体的脂质代谢及作为局部能量储存库，在骨形成和造血支持中发挥重要作用，而且脂肪组织还具有内分泌调节功能，释放出一系列重要的分泌性因子，在调节骨髓间充质干细胞向脂肪细胞分化过程中起关键作用。　　 骨质疏松患者骨髓中脂肪细胞增多，成骨细胞减少，且两者存在此消彼长的关系。因此，骨髓中脂肪组织含量的增多与骨形成能力的降低存在密切联系。骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcells，BMSCs)是在骨髓中发现的，来源于中胚层的一类具有自我更新及多向分化能力的干细胞。BMSCs在不同诱导条件下，可以分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞及成纤维细胞等多种细胞系。　　 BMSCs作为成骨细胞和脂肪细胞共同的前体细胞源，其向成骨细胞方向和脂肪细胞方向分化的平衡对骨稳态的维持起着非常重要的作用。如果BMSCs过多地向脂肪细胞方向分化，则向成骨细胞方向分化的细胞数量相应减少，就会打破骨形成与骨吸收之间的动态平衡进而引起骨量减少导致骨质疏松的发生。　　 因此，BMSCs的分化方向及其调控机制在骨质疏松症的发病机制中发挥重要作用。BMSCs的分化方向受多种因素、多个信号途径的调节。其中Wnt信号通路通过旁分泌或者自分泌的方式影响细胞的增长和分化。最主要的是Wnt/β-Catenin经典传导通路。当细胞外因子Wnt与低密度脂蛋白受体相关蛋白5或6（LRP5/6）、跨膜受体Frizzled胞外N端富含半胱氨酸的结构结合后，受体复合物作用于胞质内的Dishevelled(Dsh)，使其高度磷酸化被激活，活化后的Dsh蛋白切断β-Catenin的降解途径，抑制β-Catenin蛋白降解和磷酸化，使其在胞质内聚集，并进入核内与核内转录因子(TCF/LEF)相互作用，启动下游靶基因的转录和表达，调节成骨细胞的增殖分化，影响骨形成。　　 研究目的　　 本实验旨在研究骨髓间充质干细胞来源的脂肪细胞在成骨细胞发生分化及骨形成过程中的抑制作用机制。　　 研究方法　　 1.细胞共培养:使用三种不用浓度的脂肪细胞诱导剂诱导人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)向脂肪细胞方向分化，14天后与骨髓间充质干细胞共培养，再同时向成骨细胞方向诱导分化。共培养有两种模式:脂肪细胞和骨髓间充质干细胞直接接触(ModeA)和非直接接触(ModeB)。　　 ModeA:组i，组ii，组iii分别使用无脂肪细胞诱导剂、半量脂肪细胞诱导剂和全量脂肪细胞诱导剂诱导hBMSCs向脂肪细胞方向分化，14天后组i、组ii、组iii同时更换为成骨细胞诱导剂加脂肪细胞维持培养液，向成骨细胞方向诱导分化。脂肪细胞和成骨细胞在同一培养皿内直接接触。　　 ModeB:采用Transwell双层细胞培养板，在上层的Netwellinserts中，组i、组ii、组iii分别使用相应浓度的脂肪细胞诱导剂（同上）诱导hBMSCs向脂肪细胞方向分化;7天时，接种hBMSCs到培养板下层的Snapwell中维持培养。诱导脂肪细胞14天后将上层的Netwellinserts和下层的Snapwell合并在一起，更换为成骨细胞诱导剂加脂肪细胞维持培养液，向成骨细胞方向诱导分化。脂肪细胞和成骨细胞非直接接触。　　 2.形态学分析及分化标志物检测:ModeA共培养14天后进行碱性磷酸酶(ALP)染色、油红染色，28天后进行茜素红染色并采用NorthernEclipse图像定量分析软件和ALP活性检测试剂盒分析了ALP阳性面积和ALP活性的变化;ModeB共培养14天后进行ALP染色、同样的方法分析ALP阳性面积和ALP活性的变化，并分别收集Netwellinserts和Snapwell中的细胞，采用Westernblot检测成脂分化标志物-Ppar(y)和成骨分化标志物-Runx2的表达变化。　　 3.mRNA芯片分析:分别收集ModeB组i、组ii、组iiiSnapwell中的细胞提取纯化RNA后进行芯片分析;并采用RT-PCR验证S100A6的mRNA水平变化。　　 4.双向凝胶电泳和MALDI-TOF/TOF质谱分析:分别收集ModeB组i、组ii、组iiiSnapwell中的细胞提取蛋白进行双向凝胶电泳，Sypro-Ruby染色后酶解差异蛋白点，ZipTip纯化样品后点靶进行MALDI-TOF/TOF质谱分析、搜库鉴定及及数据分析;并采用WesternBlot验证Calreticulin、AnnexinA2和S100A6蛋白水平表达变化。　　 5.人脂肪因子芯片分析:分别收集ModeB共培养4天后组i、组ii、组iii的培养液进行脂肪因子芯片分析。　　 6.活性TGF-β1含量测定:分别收集ModeB共培养4天、7天、10天、14天后组i、组ii、组iii的培养液，ELISA试剂盒检测培养液中活性TGF-β1的含量。　　 7.TGF-β中和实验:在ModeB组iii共培养0天、4天、7天、10天更换培养液时分别加入5μg/ml和10μg/mlTGF-β中和抗体，相同体积的PBS作为阴性对照。处理14天后，进行ALP染色和ALP活性测定，Westernblot检测Runx2、β-Catenin、S100A6和Calreticulin蛋白水平变化。　　 研究结果　　 1.形态学检测分析，在ModeA中，随着脂肪细胞诱导剂量的增加，油红染色示脂肪细胞的数目逐渐增多，而ALP和钙化结节逐渐减少。同样，在ModeB中，随着脂肪细胞诱导剂量的增加，ALP表达逐渐减少。ModeA和ModeB中ALP染色面积和酶活性测定也随着脂肪细胞诱导剂量的增加逐渐减少。同时Westernblot结果验证了随着脂肪细胞诱导剂量的升高，骨形成标志物-Runx-2表达水平下降，脂肪细胞形成标志物-Ppar(y)表达水平上升。　　 2.mRNA芯片结果显示，随着脂肪细胞诱导剂量的增加，230个基因表达水平下降，149个基因表达水平上升，其中与成骨细胞形成相关的基因-COLlA1、Notchl、BMP6和S100A6在组ii和组iii中的表达水平与组i相比明显下降。相反，与脂肪细胞形成相关的基因-Calreticulin、Ppar(y)和SMAD6在组ii和组iii中的表达水平与组i相比明显升高。同时采用RT-PCR验证了S100A6在三组中的表达水平，其结论与mRNA芯片分析结果一致。蛋白质组学分析显示有5个与成骨细胞分化相关的蛋白如AnnexinA2和S100A6在组ii、组iii中的表达水平与组i相比明显下降;7个与脂肪细胞形成相关的蛋白如Calreticulin在组ii、组iii中的表达水平与组i相比明显上升。采用Westernblot验证AnnexinA2、S100A6和Calreticulin的表达水平变化，其变化趋势与蛋白质组学结果相一致。其中，S100A6和Calreticulin在基因水平和蛋白水平都被检测出存在显著差异。　　 3.脂肪因子芯片分析结果显示有23个细胞因子，如TGF-β，在组ii、组iii中的表达水平与组i相比明显上升;同时有25个细胞因子，如MCP-3，在组ii、组iii中的表达水平与组i相比明显下降。采用ELISA试剂盒检测培养液中活性TGF-β1的含量，结果显示组ii和组iii中活性TGF-β1的含量与组i相比明显升高，并且这种变化趋势从4天一直持续到14天。为了明确TGF-β1在骨形成中的作用机制，加入TGF-β中和抗体后，形态学检测发现成骨细胞数量、ALP染色阳性面积和酶活性都明显升高。Westernblot分析发现与骨形成相关的蛋白-Runx2、β-Catenin和S100A6的表达水平显著升高，而Calreticulin的表达水平明显下降。　　 研究结论及意义　　 随着脂肪细胞诱导剂量的升高，成骨细胞的分化及骨形成逐渐减少。其中在mRNA水平和蛋白表达水平均有显著差异变化的两个关键基因-S100A6和Calreticulin通过作用于β-Catenin，调控Wnt/β-Catenin信号传导通路来影响成骨细胞的分化和骨形成。重要的分泌性细胞因子TGF-β可通过S100A6和/或Calreticulin间接作用于β-Catenin，通过Wnt/β-Catenin信号传导通路干预成骨细胞的分化。这些结果揭示了骨质疏松患者骨量和骨形成减少的部分原因，可为以后进一步探索脂肪细胞在骨形成过程中的抑制作用机制提供新的线索。同时为骨质疏松的预防和治疗提供新的靶点，开拓新的视野。