嵌合体是指将两种或多种具有不同遗传性状的胚胎或多能性细胞和早期胚胎聚合或经显微注射后所发育产生的一个个体。嵌合体是发育生物学研究非常重要的技术手段,同时嵌合体发育,尤其是生殖系嵌合已经成为多能性干细胞(胚胎干细胞、诱导性多能干细胞)发育潜能的重要鉴定标准。哺乳动物中小鼠的嵌合体研究是最广泛的,也是最深入的,但是其他物种方面的研究则相对较少。猪是重要的畜牧生产物种,同时也是重要的人类医学模型,针对猪的多潜能干细胞研究近些年也得到越来越多的重视。作为检验干细胞多能性重要标准之一的嵌合体发育在猪上也同样得到了大家的关注。尽管早期有些关于猪嵌合体研究的报道,但是相对来说这些研究还很不系统,对于猪胚胎发育的特殊规律重视还不够。针对这种现状,本次实验首先建立了慢病毒载体介导制作绿色荧光蛋白标记胚胎的技术体系,在此基础上探讨了不同发育阶段胚胎之间的嵌合发育规律,同时也初步探讨了部分猪iPS细胞系的嵌合发育能力,希望为今后该类研究能够提供较为坚实的技术基础。实验结果如下1慢病毒介导的GFP转基因猪胚胎体系研究(1)同时期胚胎注射不同滴度慢病毒,其中2×109I.U./ml的慢病毒感染猪胚胎组中,体外受精(In Vitro Fertilization,IVF)和孤雌胚胎感染阳性率(80.00%、76.36%)和阳性囊胚率(90.74%、89.56%)都显著(P<0.05)高于其它组,囊胚期的荧光强度也显著高于其他组,2×lO8I.U./ml滴度感染胚胎效率其次,2×107I.U./ml滴度的慢病毒感染效率最差。(2)同一滴度慢病毒感染不同时期胚胎,2×109I.U./ml的慢病毒感染猪2-cell胚胎组中,IVF和孤雌胚胎感染阳性率(80.00%、76.36%)和阳性囊胚率(90.74%、89.56%)都显著(P<0.05)高于2×109I.U./ml的慢病毒感染猪1-cell胚胎组胚胎感染阳性率(60.07.00%、57.51%)和阳性囊胚率(79.17%、75.29%)；囊胚期的荧光强度也显著高于1-cell组；在2×108I.U./ml的慢病毒注射到两种胚胎后同样得到和上述一致的结果。(3)当慢病毒滴度是2×107I.U./ml或低于2×107I.U./ml时,即便在2-cell时期注射也几乎无法有效感染猪胚胎。另外,慢病毒感染的两种胚胎与对照组在卵裂率、囊胚率和囊胚细胞数三个指标上没有显著差异(P>0.05)。2不同发育时期胚胎聚合发育研究(1)同步发育胚胎聚合后,在8-细胞胚胎之间的嵌合率(75.00%)高于4-细胞胚胎之间和2-细胞胚胎之间的嵌合率(65.00%、53.80%,P<0.05)(2)非同步发育胚胎聚合后,2-细胞胚胎之间嵌合囊胚率和2-细胞卵裂球互换嵌合囊胚率(53.85%、62.50%)显著高于2-细胞胚胎与4-细胞胚胎的嵌合率(18.60%,P<0.05)。3iPS嵌合胚胎的研究(1)在2-cel1、4-cell和8-cell胚胎期注射具有绿色荧光标记的iPS细胞后培养1-2天后,绿色荧光消失,iPS无法嵌合到胚胎：在囊胚阶段注射,在体外培养1-2天后,部分ips细胞可以贡献到囊胚,形成嵌合胚胎。(2)几种iPS嵌合率的比较,68号、120号和122号iPS细胞嵌合率没有明显差异,实验组的平均囊胚细胞数多于对照组,说明一些iPS细胞已经嵌合到胚胎内。(3)胚胎移植后的结果分析,共4株iPS细胞系作为供体细胞,体内和IVF胚胎作为受体,共移植19头猪,其中68号嵌合胚移植受体后发生妊娠,但大概40天左右时间流产,胎体被吸收,获得2个胎盘。(4)胎盘的鉴定和分析,猪的胎盘为散布状,组织切片HE染色后观察到绒毛和绒毛毛细血管,PCR分析初步鉴定结果为阳性。综上所述,2×109I.U./m1的慢病毒载体感染2-细胞期胚胎转基因效率最高,对猪胚胎发育没有明显影响。8-细胞胚胎间聚合后的嵌合发育率显著高于其他实验组；同步发育胚胎间的嵌合率高于非同步发育胚胎间的嵌合率。在桑葚胚前注射iPS无法形成嵌合胚胎,囊胚期注射iPS可以形成嵌合体,胚胎移植后获得流产胎盘,初步分析表明iPS细胞参与胎盘发育。