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研究目的:通过cAMP反应元件调节因子(cAMP-responsive element modulator,CREM)研究Catsper基因的转录调控机制,探讨“促育生精方”治疗小鼠不育症的效果及其机理。研究方法:1.探讨CREM沉默对Catsper1 mRNA和蛋白表达量的影响。方法:构建靶向小鼠CREM基因的小干扰RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达慢病毒,用CREM shRNA慢病毒转染精母细胞GC-2spd,应用荧光显微镜检测其转染效率,根据转染效率选择最适转染浓度,72小时后提取GC-2spd细胞中的总RNA和总蛋白质,分别应用qRT-PCR技术和Western blot技术在mRNA和蛋白水平上检测细胞中CREM的沉默效率以及Catsper1表达量的变化。2.检测与CREM转录因子相关的mRNA和蛋白的表达量,分析CREM沉默后对其相关蛋白表达量的影响。方法:CREM基因沉默后,分别应用qRT-PCR技术和Western blot技术在mRNA和蛋白水平上检测细胞中睾丸特异性CREM激活因子(activator of CREM in testis,ACT),CREB结合蛋白(CREB binding protein,CBP)的表达量。3.探讨Catsper1启动子序列中是否存在可与CREM转录因子直接结合的CRE位点。方法:抽提GC-2spd细胞核蛋白,根据文献报道设计并合成Catsper1启动子序列中覆盖CRE位点的探针,对探针进行生物素标记。应用凝胶迁移实验(Electrophoretic mobility shift assay,EMSA)使核蛋白粗提液与生物素标记探针进行体外结合反应,电泳、转膜及化学发光显色分析Catsper1启动子序列中是否存在可与CREM转录因子结合的CRE位点。4.探讨CREM-CBP二聚体抑制剂对Catsper1、CREM和CBP表达的影响。方法:应用CREM-CBP二聚体抑制剂(666-15)阻断GC-2spd细胞中CREM与CBP的结合,从而阻断二聚体的形成。24小时后提取GC-2spd细胞中的mRNA和蛋白质,分别应用qRT-PCR技术和Western blot技术在mRNA和蛋白水平上检测药物干预后GC-2spd细胞中Catsper1、CREM和CBP的表达。5.探讨“促育生精方”治疗小鼠不育症的效果及其机理。方法:将50只雄性清洁级昆明小鼠随机分为空白对照组(CG)、少弱精症模型组(MG)、促育生精方干预组(低剂量组(SG)、中剂量组(MDG)和高剂量组(HG)),每组10只,小鼠适应性喂养一周,分别给MG、SG、MDG、HG组小鼠腹腔注射环磷酰胺(CP),浓度为60mg/kg,持续5d,建立少弱精症小鼠模型,CG组腹腔注射生理盐水。促育生精方干预组在造模后给予促育生精方灌胃治疗35天,剂量分别为0.45,0.90,1.80g/kg,CG、MG组生理盐水灌胃。光学显微镜下观察精子密度与精子活力,采用qRT-PCR法检测各组小鼠睾丸组织中ACT,CREM,Catsper1 mRNA的表达;用Western blotting方法检测各组ACT,CREM,Catsper1蛋白的表达。结果:1.GC-2spd细胞中CREM基因沉默后,Catsper1 mRNA和蛋白的表达量均显著降低(P<0.01)。2.CREM基因沉默后,ACT mRNA和蛋白的表达量显著下降(P<0.01),CBP mRNA和蛋白的表达量显著升高(P<0.05)。3.设计的覆盖CRE位点的探针可与GC-2spd细胞中的CREM转录因子发生体外结合。4.使用CREM-CBP二聚体抑制剂干预GC-2spd细胞后,Catsper1 mRNA和蛋白的表达量显著升高(P<0.05),CREM mRNA的表达量显著降低(P<0.05),但其蛋白的含量显著升高(P<0.05),CBP mRNA和蛋白的表达量均略微增加,但无统计学意义。5.探讨“促育生精方”治疗小鼠不育症的效果及其机理的实验中,MG组精子密度与精子活力较CG组均显著降低(P<0.05),且MG组ACT,CREM,Catsper1 mRNA和蛋白的表达量较CG组也显著降低(P<0.05),说明少弱精症小鼠模型建造成功。给药各组精子数目显著高于MG组(P<0.05),且HG组效果最好;给药各组a级和a+b级精子率均显著高于MG组(P<0.05),且SG组效果最好。与MG组相比,各给药组ACT,CREM,Catsper1 mRNA和蛋白的表达量均明显提高(P<0.05),且MDG组提高最明显。结论:1.CREM转录因子可调控Catsper1mRNA和蛋白的表达,其作用的方式可能为CREM单体直接与Catsper1启动子区的CRE位点结合,而非以CREM-CBP二聚体形式起作用的。2.“促育生精方”可提高少弱精症小鼠的精子数目、改善精子质量,在分子水平上,可上调少弱精症小鼠ACT,CREM,Catsper1 mRNA和蛋白的表达量,该结果提示上调少弱精症小鼠ACT,CREM,Catsper1的表达可能是“促育生精方”改善小鼠精子质量的途径之一。