论文部分内容阅读
石磺科（Onchidiidae）属软体动物门（Mollusca）、腹足纲（Gastropoda）、直神经亚纲（Euthyneura）、有肺类（Pulmonata）、缩眼目（Systellommatophora），是一群裸露无贝壳、雌雄同体、有自由生活幼虫期的两栖性贝类。广泛分布于印度—太平洋沿岸海域，我国黄海、东海和南海沿岸均有分布，是海洋和陆地的过渡种。主要栖息在海边高潮区的岩石、滩涂、沙砾及红树林地带；也有少数种属生活在半咸水的河口，内陆淡水及高海拔雨林。石磺是腹足纲直神经亚纲中唯一能够在海水、淡水、陆地分布的一类生物，被学者认为是由海洋向陆地辐射生活的很好代表，深入研究其辐射过程会帮助人类更好的了解水栖向陆栖的宏观进化模式，因此石磺科贝类线粒体基因组和转录组的研究具有非常重要的科学价值。在本实验室瘤背石磺（Onchidium struma）和平疣桑椹石磺（Platevindexmortoni）线粒体全基因组研究的基础上，运用鸟枪法测序技术，对里氏拟石磺线粒体全基因组进行测序，为石磺科贝类的研究提供基础数据，并通过里氏拟石磺线粒体全基因组的分析，熟练掌握线粒体基因组的分析方法。实验结果表明，里氏拟石磺线粒体全基因组为13842bp，包括13个蛋白质编码基因，22个tRNA基因，2个rRNA；因为其与瘤背石磺和平疣桑椹石磺的亲缘关系很近，通过里氏拟石磺的实验数据和分析结果及线粒体基因组分析方法，对本实验室之前2种石磺线粒体基因组的研究作一些补充和纠正，为石磺进化生物学的研究奠定基础。近年来，随着石磺科贝类研究的逐步深入，其解剖学、生态学和亲缘地理学的研究已经比较透彻，但其生理机能、分子机制和性状相关基因的研究未见报道；由于缺少石磺科贝类的转录组信息，许多有价值的研究无法及时开展，包括石磺皮肤呼吸相关的基因表现型分析、种内差异表达分析及与其他软体动物基因组的比较；近缘的后鳃亚纲和肺螺亚纲贝类的转录组也未见研究，因此石磺科转录组的分析显得尤为必要和迫切，以期为腹足纲贝类转录组研究产生良好的示范作用。通过de novo RNA-Seq测序，对四种石磺科贝类构建转录组文库，基于UniProt数据库与NCBI NR数据库的蛋白质序列，将拼接的转录本（contig）与之比对后，进行GO功能注释分析和Pathway注释分析，帮助人们深入研究石磺的宏观进化模式，为生物的进化提供有力证据。1.应用Illumina HiSeq-2000双末端测序技术（Pair-end sequencing, PE)，基于转录组测序流程及数据分析方法，对中国石磺科的四属种石磺进行转录组测序。在确保得到了高质量的数据后，利用Trinity和TGICL软件进行De novo拼接，分别得到有效序列：Platevindex mortoni60,219,324条、Paraoncidium reevesii89,062，542条、Onchidium struma62,624,204条、Peronia verruculata61,663,900条，总共近27.8Gb的数据量。与Nr数据库、Swissprot数据库、GO分类和COG数据库比对，分别有13,558、17,929、16,203、20,610个转录本被注释或分类。通过Unigene N50对转录组拼接进行效能评价，得到四属种石磺的Unigene N50分别为：723bp、485bp、557bp、778bp。2.在差异表达分析中，四种石磺至少被一个库标记（UniProt数据库或NCBINR数据库）的Unigene的个数分为：Platevindex mortoni （M）14,897条、Paraoncidium reevesii （R）27,154条、Onchidium struma（S）45,346条、Peroniaverruculata（V）23,717条。同时，GO分类和KEGG代谢通路定位表明这些基因涵盖了各个生物学功能和代谢途径，并从中获得了大量呼吸、生长、繁殖和免疫相关的候选基因。3.采用生物信息学对四属种石磺的转录组进行SSR检测和SNP预测。SSR位点存在于大多数生物的基因组中，被广泛的应用于遗传杂交育种和绘制染色体遗传图谱等领域，由于核心序列重复数不同，可呈现出多态性。对样品中SNP的检测有助于研究单核苷酸的变异引起的蛋白质功能的变化，从而作为四种石磺各基因型与表现型的检测依据。本试验系统检测了四种石磺表皮组织中的SNP位点。结合四种石磺的表达谱分析，采用PAML软件对来自不同物种的蛋白同源组（ortholog group）蛋白序列进行进化分析（采用NJ算法），并采用ClustalX2进行作图，分析结果与本实验室陈诚的亲缘地理学研究差异较大，其原因可能与石磺科贝类的蛋白质变异度较大有关。本研究丰富了石磺科贝类cDNA数据资源，不仅为探讨石磺科贝类呼吸相关基因和抗逆性相关基因的作用机理及调控机制研究奠定了坚实的基础，同时也能为石磺科贝类由海洋向陆地演化的分子生物学研究提供重要证据。