坏死性小肠结肠炎(necrotizing enterocolitis,NEC)是新生儿期最常见的胃肠道急症,主要发生于早产极低出生体重儿。活产婴中发病率约为1‰,早产极低体重儿发病率达7%；随着现代NICU技术和新生儿学的发展,早产极低体重儿的存活率不断提高,NEC发病率也有增加的趋势。该病病死率高达15%-30%,存活者也常遗留不同程度的后遗症,包括肠狭窄、短肠综合征、反复发作的脓毒血症、生长发育迟缓和神经发育障碍等。严重病例常伴有肠壁坏死、穿孔、腹膜炎,全身炎症反应综合征和多器官衰竭,病死率高达100%。虽然早产、人工喂养、肠缺氧缺血和异常的细菌定植是NEC的已知高危因素,但该病具体的发病机制仍未完全明了,也尚无确实有效的预防和治疗措施。最近研究认为炎症级联反应在新生儿坏死性小肠结肠炎的发病过程中发挥了重要作用。有学者认为NEC是早产儿特征性肠道菌群定植所诱发的炎症反应失控而造成的。大量炎性介质、受体和信号传导通路参与该病的病理生理过程,但具体哪些在炎症反应中起关键作用并可作为潜在的预防和治疗的调控靶点并未清楚。Toll样受体是先天免疫模式识别受体(pattern recognition receptors, PRRs)家族之一,广泛表达于人体各种组织细胞中,可对病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)进行识别、结合,并引发一系列信号转导,激活免疫细胞释放细胞因子,启动获得性免疫应答,是链接先天性免疫和获得性免疫的桥梁。TLR4是第一个被发现的人类TLRs,也是目前研究的最为清楚的TLRs,其主要配体是G(-)菌细胞壁的脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)成分。近年来TLR4在新生儿NEC发病机制中的作用逐渐受到重视。正常肠上皮细胞TLR4呈低表达,而在NEC患儿和动物模型中均呈现高表达。早产、人工喂养、缺氧等NEC的高危因素均可导致TLR4表达增高。TLR4活化后可激活核转录因子-κB (NF-κB),进而诱导下游炎性因子如IL-6、TNF-α等表达,启动炎症级联反应。大量的炎性介质导致肠上皮细胞损伤和粘膜防御机制破坏,最终发展为NEC,并可诱导细菌易位(bacterial translocation, BT)和白细胞活化,刺激局部和全身细胞因子释放,引发全身炎症反应综合征,脓毒血症和多器官衰竭。NEC可以在数小时内从轻微症状迅速恶化为肠坏死、穿孔和腹膜炎等。因此,预防显得尤为重要。母乳含有多种生物活性物质,具有抗炎和抗微生物作用,可以减缓NEC的发生。促红细胞生成素(erythropoietin, EPO)是一种多效细胞因子不仅可促进机体生成红细胞,还具有多种非造血功能,如抗炎、抗凋亡和血管生成等。母乳和鼠乳中含有EPO,新生儿和新生鼠肠道中有EPO受体,提示EPO在胃肠道生长发育过程中可能具有生理学作用。Ledbetter等在一项回顾性研究中发现通过注射途径给予EPO(200U/kg.d与营养液一起持续静脉输注,或400U/kg.次皮下注射,3次/周)预防和治疗早产儿贫血,结果接受治疗的早产儿其坏死性小肠结肠炎的发生率明显低于未接受EPO治疗的早产儿,提示EPO可能在坏死性小肠结肠炎的预防和治疗中有重要的作用。但是注射给药有可能造成局部皮肤感染；另外由于EPO受体广泛分布、表达于各种非造血组织,经注射途径给药会造成全身不良反应,而经肠道给药作用于局部,很少全身吸收。本研究采用人工喂养及缺氧冷刺激建立新生大鼠NEC模型,在代乳品中添加近似母乳生理浓度的EPO进行干预,观察经肠道补充EPO对新生大鼠肠组织TLR4、NF-κB、IL-6、SIgA、MUC2动态变化及肠损伤和细菌易位的影响,探讨EPO对NEC的保护作用及可能机制。实验材料及方法一、实验材料1、实验动物：SPF级3日龄SD新生大鼠,雌雄不限,体质量5.12～10.20g,由广州中医药大学实验动物中心提供,合格证号SCXK(粤)2008-0020,使用许可证号SYXK(粤)2008-0092。动物饲养于广州中医药大学第一附属医院实验中心SPF级动物实验室(动物实验环境设施监测合格证号：粤监证字2008C067号),室内温度28℃～30℃,湿度45%-65%,采用12h/12h昼夜间断照明。2、主要试剂及药品：惠氏S-26金装爱儿加早产奶粉(美国惠氏公司)大鼠IL-6ELISA检测试剂盒(R&D公司,美国),大鼠MUC2ELISA检测试剂盒(上海蓝基生物科技有限公司),大鼠SIgA ELISA检测试剂盒(上海蓝基生物科技有限公司),促红细胞生成素(沈阳三生制药有限公司产品)3、主要仪器：BX50光学显微镜(日本OLYMPUS公司),RM2255型石蜡切片机(德国LeiCA公司),7500荧光定量PCR仪(美国ABI公司),9700PCR仪(美国ABI公司)二、实验方法1、新生大鼠坏死性小肠结肠炎模型的建立参照文献,采用鼠代乳品人上喂养及缺氧冷刺激(100%氮气缺氧90s、4℃冷刺激10min,每天3次,连续3d)的方法建立新生大鼠NEC模型；代乳品的配置参考Auestad等的方法,3大营养物质的含量及热卡分别为脂肪116.3g·L-1,蛋白质107g·L-1,糖类27g·L-1,热量6616kJ·L-1,采用24G的硅胶管4次/日灌胃进行人工喂养,首次喂养量为0.15m1,逐渐增加到0.35ml。2、实验方案及标本采集和处理实验1：研究EPO对新生大鼠NEC模型肠损伤及细菌易位的影响,75只新生大鼠随机分为以下3组,每组25只。正常对照组(normal control group):新生大鼠继续与母鼠同笼,鼠乳喂养,不做任何干预。NEC模型组(NEC model group, NEC):新生大鼠与母鼠分离,置于保育箱中,采用鼠代乳品人工喂养,并定期给予缺氧冷刺激(100%氮气缺氧90s、4℃冷刺激10min,每天3次,连续3d),以建立新生大鼠NEC模型。EPO干预组(EPO intervention group, NEC+EPO):采用代乳品中添加与母乳生理浓度相近的EPO(0.1u/ml)人工喂养,同时予缺氧冷刺激。各组动物于造模后72h心脏穿刺采血后处死,按以下方法处理和保存标本：(1)采血0.05m1置于EDTA.K2抗凝管中,-80℃冰箱保存,用于总细菌DNA检测。(2)留取近回盲部末端回肠2cm固定于10%中性甲醛中,石蜡包埋、制成3μm切片,HE染色后做组织病理学检查。实验2：研究EPO对新生大鼠NEC模型肠组织TLR4、NF-κB、IL-6、SIgA、MUC2动态变化的影响,90只新生大鼠按以上实验方案随机分为3组,每组30只。各组动物于造模后24、48、72h分别心脏采血后处死10只大鼠,切取末端回肠3cm,平均分成二部分。一部分在pH7.4的磷酸盐缓冲液中漂洗后-80℃保存,用于定量RT-PCR、ELISA研究；另一部分固定于10%中性甲醛中,石蜡包埋,制成3μm切片,HE染色后做组织病理学检查。3、观察指标和检测方法(1)每天观察大鼠一般状态、排便、体重及死亡情况。(2)病理形态学研究①各组动物于各时间点处死后,打开腹腔肉眼观察肠腔积气、出血、坏死等NEC样病变。②光镜观察：回肠组织常规固定后,HE染色,光镜下观察肠组织病理学变化并进行组织损伤评分,肠组织病理评分参照文献标准：0分,肠绒毛及上皮完整,组织结构正常；1分,轻微黏膜下和(或)固有层肿胀分离；2分,中度黏膜下和(或)固有层肿胀分离,黏膜下和(或)肌肉层水肿；3分,重度黏膜下和(或)固有层肿胀分离,黏膜下和(或)肌肉层水肿,局部绒毛脱落；4分,肠绒毛消失伴肠坏死。取样品中观察到的最高分数确定肠道的损伤程度,组织学评分≥2分确定为NEC。(3)细菌易位检测：实时荧光定量PCR检测血标本中细菌16S rRNA基因。在40个PCR循环内,有Ct值的标本判断为细菌DNA阳性,表明发生了细菌易位：无Ct值的标本判断为细菌DNA阴性,表明未发生细菌易位。(4)实时荧光定量PCR检测回肠组织TLR4、NF-κB mRNA的动态变化。(5) ELISA法检测回肠IL-6、SIgA、MUC2的动态变化。4、统计学分析采用SPSS17.0软件进行统计分析,计量资料结果以x±s表示。多组间比较用单因素方差分析,进一步两两比较采用LSD-t检验。肠组织病理评分比较采用Kruskal-Wallis H检验；发病率和细菌易位发生率比较采用χ2检验;P<0.05为差异有统计学意义。结果实验1结果一、大鼠的一般情况正常对照组大鼠生长发育良好；NEC模型组大鼠造模48-72h后相继出现腹胀、腹泻,活动减少,神倦嗜睡,体质量下降等；严重者出现频繁呕吐,紫绀,呼吸窘迫和苍白。EPO干预组上述症状明显减少,体质量缓慢增长。有3只大鼠(NEC模型组2只、EPO治疗组1只)因喂养问题于造模72h内死亡,各组动物存活率为：正常对照组100%(25/25),NEC模型组92%(23/25),EPO治疗组96%(24/25)。二、大鼠肠组织病理学变化1.大体形态改变NEC模型组大鼠肠组织充血、水肿、肠腔积气、扩张明显；EPO干预组大鼠肠腔扩张、积气较模型组减轻；正常对照组大鼠肠组织无异常改变。2.光镜下病理变化正常对照组肠绒毛完整,上皮细胞排列整齐,无明显异常改变。NEC模型组肠上皮细胞排列紊乱,绒毛间质充血,细胞水肿,部分绒毛坏死、脱落消失,黏膜下和固有层分离,黏膜下和肌肉层水肿,肌层变薄,大量炎性细胞浸润。EPO-干预组与模型组相比,肠绒毛充血、水肿较轻,炎性细胞浸润减少。三组大鼠肠组织病理学评分(平均秩和分别为17.6800,53.8696,39.4583)差异有统计学意义：3个样本间两两比较,差异均有统计学意义(P<0.05)三.NEC发病率根据组织病理评分判断各组大鼠NEC发病率,结果为正常对照组0%(0/25),NEC模型组57%(13/23),EPO治疗组25%(6/24)。EPO干预组发病率明显低于NEC模型组[25%(6/24)vs57%(13/23)],差异有统计学意义(P<0.05)。四.细菌易位发生率根据血标本16SrRNA实时荧光定量PCR检测结果判断各组大鼠BT发生率：结果为正常对照组0%(0/25),NEC模型组65%(15/23),EPO治疗组17%(4/24)。EPO干预组BT发生率明显低于NEC模型组,差异有统计学意义(P<0.05)。实验2结果一.各组动物回肠组织TLR4、NF-κB mRNA及IL-6动态表达正常对照组TLR4、NF-κB mRNA及IL-6呈稳态低表达。NEC模型组TLR4mRNA在24h出现高表达,峰值在48h,72h略有下降,各时间点表达值均较正常对照组明显升高(P<0.01)；EPO干预组TLR4mRNA24h也出现高表达,但随后迅速下降,48h和72h表达值明显低于NEC模型组(P<0.01)。NEC模型组NF-KBmRNA、IL-6表达值在48、72h明显高于正常对照组(P<0.01)；EPO干预组在48h也出现高表达,72h明显低于NEC模型组护<0.01)。二.各组动物回肠组织MUC2及SIgA的动态表达正常对照组MUC2呈平均稳态表达;NEC模型组MUC2在24h出现低表达,而48h迅速回升接近正常对照组水平,72h后处于稳态表达；EPO干预组造模24h未出现表达下降,48h后迅速升高超过正常对照组水平,72h后达峰值。NEC模型组除24h表达值较正常对照组降低外(P<0.01),48h、72h时无统计学差异。EPO干预组72h表达值较正常对照组和NEC模型组均明显升高(P<0.05)。正常对照组SIgA呈平均稳态表达；NEC模型组表达呈递减趋势,各时间点表达值均低于正常对照组(P<0.01)；EPO干预组24h也出现低表达,48h后逐渐回升,72h接近正常对照组水平。与正常对照组比较,EPO干预组24、48h表达值降低(P<0.01),72h时无统计学差异；和NEC模型组比较,EPO干预组72h明显升高(P<0.01)。三.各组动物肠组织损伤动态变化造模48h内各组动物均未出现NEC样组织病理损伤,72h后模型组和EPO干预组出现组织损伤,模型组评分(2.83±0.56)明显高于EPO干预组(1.53±0.35),P<0.01。结论一.人工喂养及缺氧冷刺激可诱导新生大鼠肠组织产生接近人类新生儿坏死性小肠结肠炎样病理改变；经肠道给予生理浓度的EPO可改善新生大鼠NEC模型临床症状,减轻肠组织损伤,降低发病率。二.新生大鼠NEC模型中先天免疫应答启动早于获得性免疫应答,炎症反应早于肠道组织损伤,炎症反应是因,组织损伤是果；经肠道给予生理浓度的EPO可下调TLR4表达,抑制炎性介质的产生,从而减轻肠道组织损伤。三.新生大鼠NEC模型中肠组织黏膜屏障功能受损,经肠道给予生理浓度的EPO可上调MUC2及SIgA表达,从而保护肠黏膜机械、免疫屏障功能。四.细菌易位参与NEC的发病过程,EPO可有效减缓细菌易位的发生。