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糖尿病(DM)是一种内分泌疾病,以高血糖为主要特征,并伴有葡萄糖,脂质和蛋白质的代谢紊乱。随着DM发病率的快速增长,它已成为继心血管和肿瘤性疾病之后对人类健康构成严重威胁的第三种疾病。尽管许多药物有助于减缓2型糖尿病的进展,但长期服用会对机体产生毒副作用。因此寻找和开发高效无毒的天然降糖药物非常重要。素有“山珍之王”之称的香菇,富含多种维生素及生命必需元素,常作为高蛋白、低脂肪的理想营养保健食品。香菇多糖是香菇的主要有效成分,具有降血糖,免疫调节,抗肿瘤,抗氧化等生物活性,但目前关于香菇多糖抗糖尿病药理活性的主要机制却不清楚。因此本课题对香菇进行提取分离纯化得到香菇多糖,并对香菇多糖进行结构分析及体外活性分析,结合体外活性结果建立T2DM小鼠模型,给予DM小鼠不同剂量的香菇多糖保护,旨在探讨香菇多糖对2型糖尿病的保护作用及可能保护机制,以期对香菇多糖的抗糖尿病机制深入了解,对糖尿病的预防及治疗提供新的理论和实验基础。具体研究结果如下:(1)香菇多糖提取分离纯化及结构分析a.将香菇子实体进行沸水提取、乙醇沉淀、去蛋白得到香菇粗多糖(LNT)。将LNT经DEAE纤维素分离纯化得到三种纯化多糖,分别为水洗多糖 LNT-1,0.05mol/L 盐洗多糖 LNT-2 及 0.1mol/L 盐洗多糖 LNT-3。b.LNT、LNT-1、LNT-2及LNT-3的结构分析:①肉眼观察个多糖,LNT为棕褐色粉末状,LNT-1为淡黄色粉末状,LNT-2为淡黄色絮状,LNT-3为浅褐色絮状。②扫描电镜结果显示四种多糖形态存在较大差异。③凝胶渗透色谱分析LNT-1、LNT-2、LNT-3分子量分别为6.408 × 103Da、1.956×105Da、6.870×103Da。④红外光谱分析及核磁分析显示四种多糖均为β型吡喃糖。⑤刚果红实验证明四种多糖均不存在三股螺旋结构。(2)香菇多糖体外活性分析a.体外抗氧化:体外抗氧化结果显示,LNT、LNT-1、LNT-2及LNT-3均具有清除羟基自由基、DPPH自由基活性及总还原能力。且清除活性顺序为 LNT-1>LNT>LNT-2>LNT-3。b.体外降糖:体外降糖结果显示:LNT、LNT-1、LNT-2及LNT-3均具有抑制α-葡萄糖苷酶活性,且抑制活性顺序为LNT-1>LNT>LNT-2>LNT-3。选用LNT及LNT-1进行IR-HEPG2细胞葡萄糖消耗影响实验,与空白组相比,模型组葡萄糖消耗量降低(*p<0.01),与模型组相比,LNT组(#p<0.05),LNT-1 组均升高(#p<0.01)。(3)LNT及LNT-1对T2DM小鼠保护效果研究a.T2DM模型的构建:采用高脂高糖饮食联合STZ建立T2DM模型,发现模型小鼠出现多食、多饮、多尿及体重减少的典型“三多一少”症状。空腹血糖、血清胰岛素、TG、TC、LDL-C水平上升(#p<0.001、#p<0.001、#p<0.01、#p<0.01、#p<0.001),HDL-C 水平下降(#p<0.01),说明模型组小鼠体内糖脂代谢异常。对小鼠肝脏组织样本的H&E染色切片发现:DM组小鼠较Con组小鼠肝板结构排列不规则,肝细胞核固缩,肝小叶中央静脉明显充血,肝细胞出现空泡化。胰脏组织样本的H&E染色切片发现:模型组小鼠胰岛数量明显减少,形态不规则,胰腺呈现出严重的病理变化,表明建模过程中小鼠肝脏、胰脏受损。综合DM组小鼠生理生化指标及病理切片结果显示,本次模型建立成功。b.LNT及LNT-1对T2DM小鼠保护效果:与模型组小鼠相比灌胃LNT与LNT-1溶液4周后,小鼠“三多一少”症状缓和,空腹血糖、血清胰岛素、TG、TC、LDL-C 水平降低(#p<0.01、#p<0.01、#p<0.05、#p<0.01、#p<0.001),HDL-C 水平上升(#p<0.05,#p<0.01),说明 LNT 及 LNT-1可改善T2DM小鼠体内糖脂代谢异常。显微镜观察其肝脏组织发现细胞形态完整,结构清晰,排列整齐规则,空泡化明显减轻,中央静脉无充血现象。且LNT-1较LNT效果更佳,这与体外活性顺序相同。说明LNT及LNT-1对T2DM小鼠肝脏损伤具有保护作用。显微镜观察小鼠胰脏组织发现,胰岛数目增多,胰岛内细胞排列有序,细胞结构完整、组织正常、胞体丰盈,胰腺腺泡和胰岛细胞界限清楚。这说明LNT和LNT-1通过恢复细胞、增加有丝分裂活性,对导管干细胞具有刺激作用,以分化和再生胰岛细胞,对受损胰岛细胞具有保护作用。(4)LNT及LNT-1对T2DM小鼠保护机制研究a.经UPLC-Q-tof分析各组小鼠血清发现,潜在血清代谢物主要为脂质类,且代谢通路主要为花生四烯酸代谢及甘油磷脂代谢,说明小鼠体内产生脂质过氧化及氧化应激反应。b.基于Nrf2/HO-1通路研究LNT及LNT-1对T2DM小鼠的保护作用:灌胃LNT、LNT-1溶液四周后,T2DM小鼠肝脏组织Nrf2蛋白含量及mRNA水平升高,说明香菇多糖可以有效促进Nrf2的核转位。保护组小鼠较模型组小鼠肝脏组织HO-1蛋白含量及mRNA水平升高。表明香菇多糖可诱导Nrf2活化,导致下游抗氧化酶水平增加。说明香菇多糖在体外具备显著的抗氧化活性,且对于糖尿病的影响显著,其在体内的抗氧化活性可能通过激活Nrf2/HO-1通路,增强机体抗氧化能力,缓解氧化应激,减轻机体损伤。