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目的在免疫系统中，CD4+CD25+调节性T细胞可通过细胞直接接触及分泌细胞因子等机制调节天然及获得性免疫系统的功能，控制针对自身抗原反应的T细胞过度生长，对于维持免疫耐受及稳态具有重要作用。HIV感染中持续抗原刺激、组织损伤及不成熟状态DC的产生等可诱导CD4+CD25+调节性T细胞产生，从而影响机体针对HIV的免疫应答。研究表明，HIV感染可导致CD4+CD25+调节性T细胞数量的变化，但由于研究人群及手段的不同，结论并不一致。调节性T细胞可抑制CD8+T细胞针对HIV蛋白的特异性免疫应答，其对于HIV特异性免疫抑制不依赖于IL-10、TGF-β等细胞因子的分泌，可能通过细胞直接接触实现的，其机制可能包括共刺激分子CTLA-4的作用。目前尚无中国HIV感染者CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞作用及机制研究，本研究首次对中国不同疾病进展阶段HIV感染者“CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞”数量、与细胞毒性淋巴细胞的相关性以及调节性T细胞内CTLA-4的作表达水平进行了研究，初步探讨了调节性T细胞与HIV感染疾病进展的关系。方法1．研究对象73例未经抗病毒治疗的HIV／AIDS患者来自中国辽宁、吉林和河南，其中男性35例，女性38例，年龄分布为30-68岁(40.4±11.0)。根据HIV感染时间和CD4+T细胞数量将上述患者分为HIV感染长期不进展组(感染时间＞10年，CD4+T细胞＞500个／μl)、典型进展HIV组(感染时间＞5年，CD4+T细胞介于200-500个／μl之间，无艾滋病指征性疾病)和典型进展AIDS组(感染时间＞5年，CD4+T细胞＜200个／μl或出现艾滋病指征性疾病)。73例HIV／AIDS患者中LTNP组24例、HIV组30例、AIDS组19例。16例健康对照为随机抽取的HIV抗体阴性、未暴露于HIV的健康人，其中男性7名，女性9名。2．CD4~+T细胞绝对值及病毒载量检测CD4绝对值依据1997年美国CDC关于HIV感染者CD4~+T细胞检测指导方法，应用BD公司TruCOUNT管、FACSCalibur流式细胞仪MULTISET软件检测。病毒载量采用RT-PCR方法，用美国Roche公司的COBAS AMPLICOR自动载量仪测定病毒载量。3．CD4~+CD25~+Foxp3~+调节性T细胞检测密度梯度离心法分离HIV-1感染者及健康人PBMC。Foxp3~+细胞的检测应用PE anti-human Foxp3染色试剂盒，方法如下：向流式管1x10~+PBMC中加入anti-CD3-PerCP、anti-CD25-APC、anti-CD4-PE-Cy7，4℃避光染色30分钟。用PBS洗涤后加入1ml破膜／固定剂，4℃避光染色40分钟。洗涤后加入2％(2μL)鼠血清，4℃避光15分钟，加入anti-Foxp3-PE及IgG2a-PE同型对照，4℃避光30分钟，洗涤后加入含1％多聚甲醛的PBS重悬，FACSAria流式细胞仪Diva软件进行分析。以FSC、SSC、CD3-PerCP、CD4-PE-Cy7定义CD4~+T细胞，计算这一细胞群内CD25~+Foxp3~+细胞的比率。4．淋巴细胞活化及凋亡水平检测取HIV-1感染者及健康人全血100μl，应用以下荧光标记的单抗进行染色：CD8-FITC／CD95-PE／CD3-PerCP／CD4-APC-Cy7、HLA-FITC／CD38-PE／CD8-APC／CD4-APC-Cy7，室温避光染色30min。加入溶血素3毫升，室温避光10分钟，1200r／min离心5min，弃上清。加入3ml PBS洗涤两次，加入1％多聚甲醛的PBS重悬，FACSAria流式细胞仪Diva软件进行分析。以FSC、SSC定义淋巴细胞，分析CD4、CDS~+T细胞表面HLA-DR、CD38及CD95表达水平。5．CD8~+T细胞绝对值检测将20μlC D4FITC／CD8PE／CD3PerCP试剂加入绝对计数管中，经反向加样法加入50μl抗凝血，室温避光15min，加入免洗溶血素450μl，室温避光15min，FACS MULTISET软件检测并进行自动分析，计算CD8+T淋巴细胞绝对值。6．NK细胞绝对值检测将20μl CD45FITC／CD16+56+PE／CD3PerCP试剂加入绝对计数管中，经反向加样法加入50μl抗凝血，室温避光15min，加入免洗溶血素450μl，室温避光15min，FACS MULTISET软件检测并进行自动分析，计算NK细胞绝对值。7．NK细胞、CD8+T淋巴细胞Perforin、Granzyme-B表达水平检测密度梯度离心法分离HIV-1感染者PBMC。向流式管1x10~6 PBMC中加入anti-CD8-PerCP、anti-CD56APC、anti-CD3-APC-Cy7，4℃避光染色30分钟。用PBS洗涤后加入1ml破膜／固定剂，4℃避光染色40分钟。洗涤后加入2％(2μL)鼠血清，4℃避光15分钟，加入anti-Granzyme-B-FITC、anti-perforin-PE及相应同型对照，4℃避光30分钟，洗涤后加入含1％多聚甲醛的PBS重悬，FACSAria流式细胞仪Diva软件进行分析。以FSC、SSC定义淋巴细胞，CD3-CD56+、CD3+CD8+T淋巴细胞内Perforin、Granzyme-B表达水平分别乘以NK、CD8+T淋巴细胞绝对值获得Perforin、Granzyme-B表达水平。8．CD4~+CD25~+Foxp3~+调节性T细胞内CTLA-4表达水平检测密度梯度离心法分离HIV-1感染者PBMC。向流式管1x10~6 PBMC中加入anti-CD3-PerCP、anti-CD25-APC、anti-CD4-PE-Cy7，4℃避光染色30分钟。用PBS洗涤后加入1ml破膜／固定剂，4℃避光染色40分钟。洗涤后加入2％(2μL)鼠血清，4℃避光15分钟，加入anti-Foxp3-FITC、anti-CTLA-4-PE及相应同型对照，4℃避光30分钟，洗涤后加入含1％多聚甲醛的PBS重悬，FACSAria流式细胞仪Diva软件进行分析。以FSC、SSC、CD3-PerCP、CD4-PE-Cy7、CD25-APC、Foxp3-FITC定义调节性T细胞，计算这一细胞群内CTLA-4的表达百分率。结果1．HIV感染者CD4~+CD25~+Foxp3~+调节性T细胞水平通过单细胞水平检测外周血PBMC中CD3~+CD4~+CD25~+Foxp3~+T细胞水平发现，LTNP组、健康对照组、HIV组、AIDS组CD4~+CD25~+Foxp3~+调节性T细胞数量依次升高，HIV组明显低于AIDS组(P＜0.05)，与健康对照组无显著性差异。LTNP组CD3~+CD4~+CD25~+Foxp3~+T细胞水平明显低于HIV组及AIDS组(P＜0.01)，值得注意的是，尽管LTNP组与健康对照组相比CD4+T细胞数量并无差异，但CD3~+CD4~+CD25~+Foxp3~+T细胞水平明显低于健康对照组(P＜0.05)。2．CD4~+CD25~+Foxp3~+调节性T细胞与CD4~+T细胞、病毒载量的相关性HIV感染者CD4~+CD25~+Foxp3~+调节性T细胞与CD4~+T细胞显著负相关(r=-0.571，P＜0.001)，与病毒载量明显正相关(r=0.453，P＜0.001)。健康人CD4~+CD25~+Foxp3~+调节性T细胞与CD4~+T细胞无显著相关性。3．CD4~+CD25~+Foxp3~+调节性T细胞与淋巴细胞活化及凋亡的相关性HIV-1感染者CD4~+CD25~+Foxp3~+调节性T细胞与CD4~+、CD8~+T细胞凋亡水平呈明显正相关(CD4~+T细胞凋亡：r=0.352，P=0.002；CD8~+T细胞凋亡：r=0.359，P=0.002)，与淋巴细胞活化水平无显著相关性。4．HIV感染者NK细胞、CD8+T淋巴细胞水平通过对HIV感染者细胞毒性淋巴细胞数量检测显示，随疾病进展，LTNP组、HIV组、AIDS组NK细胞水平依次下降，其中LTNP组明显高于HIV组及AIDS组(P＜0.05)，LTNP组高于健康对照组，但无显著差异。LTNP组、HIV组、AIDS组CD8+T细胞依次下降，LTNP组明显高于AIDS组(P＜0.05)，HIV组与AIDS组间无显著差异。5．HIV感染者NK细胞、CD8+T淋巴细胞内Perforin、Granzyme-B表达水平对HIV感染者细胞毒性淋巴细胞Perforin、Granzyme-B表达的研究结果显示，LTNP组、NC组、HIV组、AIDS组NK细胞Perforin、Granzyme-B表达依次下降，其中LTNP组及健康对照组明显高于HIV组、AIDS组(P＜0.05)，HIV组与AIDS组间无显著差异。CD8+T细胞内Granzyme-B表达NC组、LTNP组、HIV组、AIDS组依次下降，其中LTNP组、HIV组、AIDS组明显高于健康对照组，各组间的差异无显著意义。CD8+T细胞内Perforin表达HIV组显著高于NC组，其余各组间无显著差异。6．HIV感染者CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞与NK细胞、CD8+T淋巴细胞及Perforin、Granzyme-B表达水平的相关性HIV感染者CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞与NK细胞、CD8+T淋巴细胞数量呈明显负相关(NK细胞：r=-0.502，P＜0.01；CD8+T细胞：r=-0.437，P＜0.001)，与NK细胞内Perforin、Granzyme-B表达水平呈明显负相关(Perforin：r=-0.515，P＜0.01；Granzyme-B：r=-0.507，P＜0.01)，与CD8+T细胞内Granzyme-B表达水平呈明显负相关(Granzyme-B：r=-0.298，P＜0.01)，与CD8+T细胞内Perforin表达水平无明显相关性(Perforin：r=-0.240，P＞0.05)。7．HIV感染者CD4~+CD25~+Foxp3~+调节性T细胞内CTLA-4表达水平通过单细胞水平检测外周血PBMC中CD4~+CD25~+Foxp3~+T细胞内CTLA-4表达水平发现，健康对照组、LTNP组、HIV组、AIDS组CTLA-4表达水平依次升高，其中LTNP表达水平(28.67±4.61)明显低于HIV组(36.71±9.99)及AIDS组(39.37±11.82，P＜0.05)，与健康对照组无显著差异(27.48±13.75)。健康对照组表达水平明显低于HIV组及AIDS组(P＜0.05)，HIV组及AIDS组间无显著差异，8．CD4~+CD25~+Foxp3~+调节性T细胞内CTLA-4表达水平与CD4~+T细胞、病毒载量的相关性HIV感染者CD4~+CD25~+Foxp3~+调节性T细胞内CTLA-4表达水平与CD4+T细胞显著负相关(r=-0.419，P＜0.05)，与病毒载量无显著相关性。9．CD4~+CD25~+Foxp3~+调节性T细胞内CTLA-4表达与淋巴细胞Perforin、Granzyme-B表达水平的相关性LTNP组CD4~+CD25~+Foxp3~+调节性T细胞内CTLA-4表达水平与CD4+、CD8+T淋巴细胞Granzyme-B表达、CD4+T淋巴细胞Perforin表达呈明显负相关(P＜0.05)，HIV组、AIDS组CD4~+D25~+Foxp3~+调节性T细胞内CTLA-4表达水平与CD4+、CD8+T淋巴细胞Perforin、Granzyme-B表达无显著相关性。结论1．LTNP组、健康对照组、HIV组、AIDS组CD4~+CD25~+Foxp3~+调节性T细胞数量依次升高，与HIV感染疾病进展明显相关。2．LTNP组CD4~+CD25~+Foxp3~+调节性T细胞表达水平低于HIV组及AIDS组，而且明显低于健康对照组，提示低水平的调节性T细胞数量对感染后疾病不进展具有保护作用。3．中国HIV感染者调节性T细胞与细胞毒性淋巴细胞数量功能的变化密切相关，提示高水平的调节性T细胞可导致细胞毒性淋巴细胞数量功能的下降，从而影响疾病进程。4．健康对照组、LTNP组、HIV组、AIDS组CD4~+CD25~+Foxp3~+调节性T细胞内CTLA-4表达水平依次升高，且与CD4~+T细胞数量显著负相关，提示CD4~+CD25~+Foxp3~+调节性T细胞内CTLA-4表达水平与疾病进展密切相关。5．HIV感染LTNP组CD4~+CD25~+Foxp3~+调节性T细胞内CTLA-4表达水平明显低于HIV组及AIDS组，与CD4+、CDS+T淋巴细胞Granzyme-B表达、CD4+T淋巴细胞Perforin表达明显负相关，提示调节性T细胞内低水平CTLA-4表达对感染后疾病不进展具有保护作用。