目的:拟用虎杖、桂枝药对,通过高效液相色谱法(HPLC)研究虎杖-桂枝6:1配伍的药效物质基础,进行方法学考察,并探讨虎杖-桂枝药对6:1配伍对尿酸钠(Monosodium Urate Crysta,简称MSU)诱导的大鼠急性痛风关节炎代谢组学的影响,从代谢途径上阐述其可能的机制。方法1.虎杖-桂枝药对配伍HPLC方法学考察与含量测定按照太平圣惠方记载虎杖-桂枝药对,根据前期药效研究,把虎杖-桂枝按照6:1进行水提,运用高效液相色谱法对色谱条件进行方法学考察,并测定虎杖-桂枝药对的药效物质基础成分含量,确定虎杖、桂枝药材是否符合2015版《中国药典》的要求,以保证药效探究中实验药材的质量。2.虎杖-桂枝药对对MSU模型大鼠足肿胀的影响2.1尿酸钠结晶诱导大鼠急性痛风性关节炎模型造模方法实验前适应环境1周,自由饮水、进食,每日12 h照明,室温(25±2)℃。1周后,开始灌胃给药,除空白组给予生理盐水外,其余组按其组别进行给药。给药体积均为10 ml/kg体重,每天一次,连续7天,第7天给药1小时后,除正常组外,各组大鼠均造急性痛风性关节炎模型,一次性注入70 mg/m L的MSU混悬液50μL,以关节囊对侧鼓起为注入标准,诱导急性痛风关节炎模型。空白组大鼠采用相同的方式注射无菌性生理盐水。2.2足肿胀率测定造模成功后,为了观察虎杖-桂枝药对干预痛风性关节炎的动态变化规律,分别在注射后的不同时间点(0,1,2,3,4,5,6,8,12,24小时)测量大鼠右后肢关节周径,每次重复测量3次,取平均值,计算大鼠关节肿胀指数[关节肿胀指数=(测定时间点关节周径-初始周径)/初始周径]。3.虎杖-桂枝药对干预急性痛风性关节炎大鼠代谢组学测定3.1造模大鼠尿液和血液的收集通过2.1造模后各组大鼠置于具有集尿器的代谢笼上,收集尿液(0-24小时),同时加入Na N3溶液0.5 m L作防腐剂,收集的尿液置于-20℃保存备用。造模24小时后,大鼠眼眶后静脉丛取血2 m L,经EDTA抗凝后离心(3500r/min,15min,4℃)得到血浆,置于-20℃保存备用。3.2样品准备血浆:室温解冻后,于5mm NMR核磁管中加入400μL血浆,加入50μL磷酸缓冲液(0.2mol/L Na HPO4-0.2mol/L Na H2PO4,p H7.4)和50μLD2O(用于锁场),振荡均匀,待测。尿液:室温解冻后,取200μL磷酸缓冲液加入400μL尿液中,静置20分钟后离心,取500μL上清液加至5mm NMR核磁管,然后加入50μLD2O(含有0.05%W/V TSP-d4),震荡混匀,待测。3.3 NMR实验NMR数据处理对所得NMR数据经傅立叶变换得到谱图,数据分析将保存的Excel格式数据输入到SIMCA-P+软件(v10.04,Umetrics,Umea,Sweden)进行多元统计分析。数据采用平均中心化(mean centering)或Pareto标度化(Pareto scaling)进行预处理之后行主成份分析(PCA)。4.ELISA法检验IL-1β、TNF-α含量在IL-1β、TNF-α微孔板中加300μL的洗液洗板两次,静置15分钟后,去掉洗液,在吸水纸上拍干,立刻加入50μL的检测缓冲液、50μL的标准品和样本溶液(此加样步骤一定要在15分钟内完成),50μL的检测抗体,用封板膜进行封板,在恒温震荡器(100r/min)上避强光孵育2小时,去掉微孔板中的液体,加300μL的洗液洗板6次(每次洗板都必须把微孔板上的残留液体拍干),接着加入100μL的辣根氧化物酶标记的链霉亲和素,用新的封板膜封板,在恒温震荡器(100r/min)上避强光孵育45小时,取出后去掉微孔板中的液体,加300μL的洗液洗板6次(每次洗板都必须把微孔板上的残留液体拍干),加100μL显色底物TMB,避光孵育10~30小时,加入100μL的终止液后颜色有蓝色变为黄色,如果颜色呈现绿色或颜色的变化明显不均匀,轻叩击板框,使其充分混匀。在30分钟内,采用酶标仪(检测波长为:570nm,630nm)测定OD值,记录实验结果。结果1虎杖桂枝药对HPLC含量测定结果根据实验中得到的虎杖苷、白藜芦醇、桂皮醛、大黄素的回归曲线方程可计算得到虎杖中虎杖苷、白藜芦醇、桂皮醛、大黄素的含量分别为0.0082、0.0054、0.0011、0.0017g。则虎杖-桂枝药对中虎杖苷、白藜芦醇、桂皮醛、大黄素的百分含量为1.36%、0.91%、1.1%、0.28%。按照2015版《中国药典》中关于虎杖相关规定:虎杖干燥品中虎杖苷(C20H22O8)含量不得少于0.15%,大黄素(C15H10O5)含量不得少于0.6%,桂枝干燥品中含桂皮醛(C9H80)不得少于1.O%。另取同一批虎杖药材,粉碎,过120目筛。精密称取虎杖粉末0.6g,加80%乙醇28ml,室温,无强光照射下超声30分钟,提取两次,合并提取液,用滤头过滤,得虎杖醇提液。采用选定的色谱条件,测得虎杖醇提液中大黄素的峰面积为1 512 805,代入3.4标准曲线中的大黄素回归方程得大黄素的含量为0.0109g,则虎杖中大黄素的百分含量为1.82%。2足肿胀测定结果此实验大鼠急性痛风关节炎模型建立成功。检测可知,与模型组相比较,在造模4小时后,大鼠足肿胀度开始减小,两者之间存在显著性差异。3虎杖-桂枝药对干预急性痛风性关节炎大鼠代谢组学结果3.1血浆与尿液的1H-NMR代谢物谱分析血浆与尿液的代谢物图谱分析得出,血浆中的代谢物有脂蛋白、脂类、糖、氨基酸、有机酸和酮体等。尿液中主要是氨基酸类、有机酸类和酮体等物质。3.2造模24小时时间点的大鼠机体代谢指纹谱的变化使用MSU混悬液诱导的大鼠机体生理及物质代谢状况已经发生了明显变化。为验证OPLS-DA模型的可靠性,采用7倍交叉验证法对其进行验证,得到了OPLS-DA模型的主要参数。血浆:R2X=0.836,R2Y=0.949,Q2=0.832;尿液:R2X=0.871,R2Y=0.996,Q2=0.859。由此可见,本文采用的模型具有较高可靠性。3.3与急性痛风性关节炎相关的潜在生物标志物的变化血浆中的潜在生物标志物有亮氨酸(Leucine)、赖氨酸(Lysine)、谷氨酰胺(Glutamine)、乳酸(Lactate)和β-葡萄糖(β-Glucose),尿液中的潜在生物标志物有丙酮酸盐(Pyruvate)、琥珀酸盐(Succinate)、α-酮戊二酸(2-Oxoglutarate)、柠檬酸(Citrate)、氧化三甲胺(Trimethylamine N-oxide)、马尿酸盐(Hippurate)。与模型组相比较,对照组和虎杖桂枝组的大鼠血清中的亮氨酸、赖氨酸(Lysine)、谷氨酰胺(Glutamine)和乳酸(Lactate)的含量明显降低,而β-葡萄糖(β-Glucose)在血浆中的含量显著增多;同样通过与模型组相比较,对照组和虎杖桂枝组的大鼠尿液中丙酮酸盐(Pyruvate)、琥珀酸盐(Succinate)、α-酮戊二酸(2-Oxoglutarate)和柠檬酸(Citrate)的含量明显降低,而马尿酸盐(Hippurate)在尿液中的含量显著增多,对照组的大鼠尿液中氧化三甲胺(Trimethylamine N-oxide)含量亦出现显著增多,虎杖桂枝药对组无明显变化。3.4 Met PA分析代谢途径通过Met PA分析影响路径拓扑分析计算信号通路的影响值大于0.1者有五个路径,分别是缬氨酸,亮氨酸和异亮氨酸生物合成(Valine,leucine and isoleucine biosynthesis)、乙醛酸和二羧酸代谢(Glyoxylate and dicarboxylate metabolism)、柠檬酸循环(Citrate cycle)、丙氨酸,天冬氨酸和谷氨酸代谢(Alanine,aspartate and glutamate metabolism)、丙酮酸代谢(Pyruvate metabolism)。4炎症因子IL-1β、TNF-α检测结果与空白对照组比较,模型组IL-1β、TNF-α炎症因子含量都有明显差异(P<0.05),具有统计学意义;虎杖桂枝药对组IL-1β含量有明显差异(P<0.05),具有统计学意义,但TNF-α含量则无明显差异(P>0.05),不具有统计学意义;与模型组比较,空白组与虎杖桂枝药对组的IL-1β、TNF-α炎症因子含量有明显差异(P<0.05),具有统计学意义。结论1.通过对虎杖桂枝药对的方法学考察,确定虎杖桂枝药对中虎杖苷、桂皮醛大黄素的含量均符合2015版《中国药典》中的相关规定,表明所用的虎杖桂枝药材符合药典规定,可以用于虎杖桂枝药对水煎液干预大鼠急性痛风关节炎药效的研究。2.空白对照组大鼠的足肿胀率明显低于模型组大鼠的足肿胀率,表明此实验大鼠急性痛风关节炎模型建立成功。与模型组相比较,在造模4小时后,虎杖水煎液组大鼠足肿胀度开始减轻,两者之间出现显著性差异,表明虎杖桂枝药对水煎液组对于炎症因子的抑制作用更强。3.与模型组相比,虎杖桂枝药对可以减少体内糖的代谢,增强血液和尿液中某些氨基酸产物的代谢,保护肠道微生物群新陈代谢,对治疗痛风性关节炎有一定的意义。4.从炎症因子IL-1β、TNF-α含量检验结果来看,急性痛风性关节炎模型很成功;与模型组比较,虎杖桂枝药对组具有明显的炎症因子抑制作用,对急性痛风性关节炎有一定的治疗作用。