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目的:构建靶向特异尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)-siRNA慢病毒表达载体后并筛选出高效靶向序列,转染兔软骨细胞,观察其对软骨细胞增殖、u PA、MMP-3基因及蛋白表达水平的影响。方法:取原代生长良好的兔膝关节软骨细胞传代接种培养,根据Gen Bank中兔u PA基因序列,参照si RNA靶点设计原则,设计、合成构建靶向兔u PA-si RNA序列,利用RT-PCR筛选高效靶向序列,按照不同的感染复数(MOI)值加入慢病毒颗粒液,共同培养后确定最佳感染复数(MOI)值,并测定分析病毒感染效率,高效靶向序列经慢病毒包装后,通过Lipofectamine 2000转染兔软骨细胞,并按实验进行随机分组,分为实验组(转染u PA-si RNA慢病毒载体组)、空载体组(转染空慢病毒载体组)、空白对照组(未予任何处理组)、药物对照组(加载MMP特异性抑制剂TIMP)。细胞离体培养96h后,应用实时定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及蛋白免疫印迹法(Western blot)分别检测软骨细胞u PA-si RNA对细胞内u PA、MMP-3 m RNA和蛋白的表达水平,并通过CCK-8法检测u PA-si RNA对软骨细胞增殖的影响。结果:慢病毒载体成功转染原代软骨细胞,通过si RNA载体质粒测序与预期si RNA序列一致,DNA测序序列正确无突变,从中筛选出高效靶向序列(即沉默效果最佳)。转染后软骨细胞培养可见,早期软骨细胞呈多角形,细胞贴壁生长;传2代时,细胞呈现梭形,并聚集生长;传5代时,细胞呈现典型纤维细胞样;符合软骨细胞生长特点,可进行后续实验。随着感染复数(MOI)的增加,慢病毒的感染效率也随之增加,当感染复数(MOI)为100时感染率超过85%,符合后续实验要求。通过CCK-8检测si RNA对软骨细胞增殖能力的影响发现,给予转染u PA-si RNA慢病毒载体后的软骨细胞增殖并未受到抑制。实验组u PA m RNA、MMP-3 m RNA及u PA、MMP-3蛋白的表达水平显著低于空载体租、空白对照组和药物对照组(P<0.05),而空载体组、空白对照组及药物对照组u PA m RNA、MMP-3 m RNA及u PA、MMP-3蛋白的表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论:成功构建高效靶向u PA-si RNA慢病毒载体,其可稳定转染兔软骨细胞并能高效抑制u PA基因及蛋白表达,也可对MMP-3基因及蛋白表达呈抑制作用,对软骨细胞增殖起到促进作用。