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研究背景:肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是我国的高发肿瘤之一,五年生存率低,严重危及人类的健康和生命,肝细胞肝癌是多血管肿瘤,恶性程度高,生长速度快,转移范围广,复发率高。研究证实PGE2可以促进肿瘤细胞的增殖、侵袭转移、肿瘤血管的形成。目前认为PGE2是通过细胞膜表面的PGE2受体( EP受体)发挥作用,EP受体为细胞膜G蛋白偶联受体,有4种亚型,分别称为EP1、EP2、EP3和EP4受体,研究发现这四种受体在HuH7肝细胞癌细胞中都有表达。VEGF是肝素结合糖蛋白,在细胞内合成后通过肝素结合位点和细胞膜上硫酸类肝素蛋白多糖结合,并通过蛋白水解作用分泌到细胞外,以二聚体形式作用于血管内皮细胞,是促进肿瘤血管形成的主要因子。An FG等发现VEGF在肝癌中广泛表达并与其临床分期、预后有关。然而PGE2是否能促进肝癌细胞HuH7 VEGF的表达以及与EP受体及其下游信号转导通路的关系还没有明确。本研究应用PGE2、四种EP受体激动剂、腺苷酸环化酶抑制剂SQ22536及PKA抑制剂H89处理人肝癌细胞HuH7,观察其VEGF表达的变化及与cAMP-PKA信号转导通路的关系。研究目的:探讨PGE2对人肝癌细胞HuH7 VEGF表达的影响及其可能涉及的信号转导通路,为PGE2促进肿瘤血管生成的机制研究提供理论依据。研究方法:1.细胞培养:取人肝细胞癌细胞株HuH7按常规方法培养。2.外源PGE2处理培养的HuH7细胞后,Real-time PCR实验检测其VEGFmRNA表达的变化。3.外源PGE2处理培养的HuH7细胞0,6,12,24h,Western Blot实验检测细胞胞浆内VEGF蛋白表达的变化。4.外源PGE2处理培养的HuH7细胞后,ELISA实验检测细胞培养上清中VEGF蛋白表达的变化。5.四种EP受体激动剂(EP1:Prostaglandin E1 Alcohol ; EP2:Butaprost ;EP3:Sulprostone;EP4:17-phenyltrinor Prostaglandin E2)处理培养的HuH7细胞后,Western Blot实验检测细胞胞浆内VEGF蛋白表达的变化,ELISA实验检测细胞培养上清中VEGF蛋白表达的变化。6.设对照组、PGE2处理组、PGE2+SQ22536(腺苷酸环化酶抑制剂)处理组、PGE2+H89(PKA抑制剂)处理组,用Western Blot实验检测细胞胞浆内VEGF蛋白表达的变化,用ELISA实验检测细胞培养上清中VEGF蛋白表达的变化。研究结果:1.以DMSO为对照,实验组10μΜPGE2处理24h后,Real-time PCR观察到实验组VEGFmRNA含量增加2.64倍,差异具统计学意义(P<0.05)。2.用10μΜPGE2分别处理HuH7细胞0,6,12,24h,细胞浆中VEGF的表达水平分别上升了13.6%,25.7%,39.6%,差异均具统计学意义(P<0.05)。3.以DMSO为对照,实验组用10μΜPGE2处理24h,ELISA实验观察到实验组细胞培养上清中VEGF的含量是对照组的1.24倍,差异具有统计学意义(P<0.05)。4.以DMSO为对照,实验组用10μΜEP1-4四种受体激动剂(EP1:Prostaglandin E1 Alcohol;EP2:Butaprost;EP3:Sulprostone;EP4:17-phenyltrinor Prostaglandin E2)处理24h后,EP2受体激动组细胞浆VEGF的表达水平与对照组相比上升了32.3%,差异具有统计学意义(P<0.05),而EP1、EP3、EP4处理组细胞浆VEGF表达量与对照组相比无明显改变(P>0.05)。5.以DMSO为对照,实验组用10μΜEP1-4四种受体激动剂(EP1:Prostaglandin E1 Alcohol;EP2:Butaprost;EP3:Sulprostone;EP4:17-phenyltrinor Prostaglandin E2)处理24h后,ELISA实验结果显示:EP2激动剂处理组细胞培养上清VEGF表达水平与对照组相比上升20.1%,差异具有统计学意义(P<0.05),而EP1、EP3、EP4处理组细胞培养上清VEGF表达量与对照组相比无明显改变(P>0.05)。6.以DMSO为对照,实验组用30μΜPKA抑制剂(H89),500μΜ腺苷酸环化酶抑制剂(SQ22536)预处理1h后加入10μΜPGE2,作用23h后PBS终止反应,Western blot观察实验结果显示:H89+ PGE2组、SQ22536+ PGE2组细胞浆中VEGF的表达水平分别为对照组的91.6%、89.6%,与PGE2组差异均有统计学意义(P<0.05)。7.以DMSO为对照,实验组用30μΜPKA抑制剂(H89),500μΜ腺苷酸环化酶抑制剂(SQ22536)预处理1h后加入10μΜPGE2,作用23h后PBS终止反应,Western blot观察实验结果显示:H89+ PGE2组、SQ22536+ PGE2组细胞浆中VEGF的表达水平分别为对照组的98.3%、91.9%,与PGE2组差异均有统计学意义(P<0.05)。研究结论:1. PGE2对HuH7细胞VEGF mRNA、蛋白的表达具有上调作用。2. PGE2对HuH7细胞VEGF表达的增强可能主要是通过EP2受体发挥作用的。3. PGE2对HuH7细胞VEGFmRNA、蛋白的表达具有上调作用可能与cAMP-PKA信号转导通路激活有关。