一、研究背景及目的面部年轻化一直是美容外科探索的课题,除了拉皮手术外,很多真皮充填物已被开发,用于消除皱纹和皮肤凹陷。自1981年牛胶原蛋白作为第一个用于去皱的充填品获FDA批准,越来越多的更安全更有效的注射物被推出。目前国内外常用的注射充填物根据来源可分为有以下几类。自体的:自体脂肪,自体细胞,自体胶原等;同种异体的:人尸体组织的胶原,人成纤维细胞培养生成的胶原;异种来源:来自于牛、猪的胶原,来自于公鸡冠或细菌发酵的透明质酸及其衍生物类产品;人工合成:硅树脂(silicone)类产品,聚甲基丙烯酸甲酯(Polymethylmethacrylate,PMMA),羟基磷灰石,聚乳酸类,聚丙烯酰胺类。非永久性注射充填物主要包括透明质酸及其衍生物类、胶原、聚乳酸类及自体细胞等;永久性注射充填物主要包括硅树脂类产品、PMMA、羟基磷灰石及自体脂肪。但是它们各有优缺点,自体脂肪存活有限,吸收率高,且只能适合富有脂肪的人;牛胶原易过敏,有效时间短;Artecoll可产生肉芽肿,且只能皮下深部注射;透明质酸钠则有效时间短:单纯成纤维细胞注射,需多次注射,价格昂贵且效果不尽人意。理想的注射充填材料应当安全,方便,无痛,不留下任何使用过的痕迹,能长期地存留,但又无任何并发症,如果要取出,它又可以容易而安全的取出;理想的注射充填材料应该生物相容性好,无免疫排斥反应,无毒性,无致传染病,致热和致癌性迁移等;最好价格不昂贵,易保存,易消毒。近年来,组织工程发展很快,在皮肤、角膜、肝、胰、软骨、骨、血管、尿道、神经系统等领域均取得了巨大的成绩。但应用组织工程技术研究可注射性真皮充填物是一个新的发展方向。其中细胞支架材料可以选择可降解生物材料氧化异丙烯Plurolic—F127和可降解的注射充填材料(透明质酸钠、胶原等),种子细胞可以选择人体容易获得的细胞,如来自皮肤和脂肪的细胞。利用组织工程技术,从少量人体的富余组织中分离出自体细胞,体外培养大量扩增,获得种子细胞,将种子细胞和可吸收的细胞支架混合,形成细胞一支架复合物,将此自体复合物回注入皱纹下的真皮层内,细胞支架逐渐降解而被吸收,自体细胞成活形成新的结缔组织,分泌大量新的细胞基质成份,从而,修复原有的真皮断裂,重建、修复皮肤结构,达到消除皱纹的目的。Pluronic-F127被广泛用于药物的缓释载体,没有细胞毒性,不会引起机体的免疫反应,常温下固化,可以塑形,4℃下为液态,而在液态状态下便于用注射器将细胞与载体的复合物注入体内,使用方便,是常用的组织工程支架材料。目前可降解的注射充填材料主要有:牛、猪的胶原,非动物源性的透明质酸及其衍生物类产品,羟基磷灰石微球,聚丙烯N,N一二甲基二烯丙基铵盐共聚物。其中非动物源性的透明质酸,因其无致敏性、容易获得且本身就是细胞基质成份,从而作为本研究的细胞支架材料。皮肤是人体最大的器官,细胞资源丰富,是一个庞大的细胞库。而且,皮肤位于体表,易于取材:通常,外科手术均需切开皮肤,因而在进行组织器官缺损修复手术的同时,可以切取少量皮肤组织,甚至可以利用手术切除的多余皮肤组织来获得大量的皮肤来源细胞。从皮肤获得种子细胞不仅安全、方便,而且还可充分利用手术废弃组织,不浪费宝贵的人体细胞资源。皮肤成纤维细胞作为种子细胞已经得到了深入的研究,Eaglstein WH用小儿包皮的成纤维细胞构建组织工程化真皮,并广泛应用于临床,促进创面愈合;陈兵等应用皮肤成纤维细胞构建组织工程化肌腱。自体培养的成纤维细胞(Isolagen)也在美国、欧洲等地治疗凹陷皱纹及痤疮后瘢痕,这是单纯细胞技术在注射除皱方面的应用,已有1450人接受过治疗。人成纤维细胞可以由皮肤中分离出来,再通过体外培养扩增,收集后可以回注到自体凹陷皱纹处,用来消除皱纹,对细浅纹有效,未发现并发症,但对稍深的皱纹则无效,可能与单纯成纤维细胞注射,细胞成活少,且细胞不易固定等有关。自2001年Zuk首次证实经吸脂术获得的脂肪组织中存在具有多向分化潜能的细胞群后,脂肪干细胞(Adipose derived stem cells,ADSCs)的概念得以明确,其后ADSCs逐渐被人们所认知并迅速进入组织工程种子细胞研究领域。与BMSCs相比,ADSCs在人体内分布范围更广,可利用的细胞总量更多,而且所需的脂肪组织可经整形外科吸脂术(美容手术)获得,该手术操作简单,创伤小,还能对病人进行体型重塑,因此,病人易于接受,无心理障碍。正是基于以上考虑,我们认为在种子细胞来源的选择上,ADSCs较BMSCs更具优势,脂肪组织作为种子细胞来源,具有更加广阔的应用前景。人们对ADSCs的认识到目前只有几年的时间。1994年,Kaplan等发现病人皮下脂肪组织中有异位成骨现象,提出脂肪前体细胞能向成骨细胞分化的推断,但其未证实脂肪组织中间充质干细胞的存在。直至2001年,Zuk等从脂肪抽吸物中成功分离培养出具有骨、软骨、脂肪、肌肉等多向分化潜能的细胞,ADSCs才真正被人们所认识。此后的许多研究也均证实了ADSCs的多向分化潜能,包括向软骨细胞、成骨细胞、内皮细胞、肌肉细胞甚至神经细胞的分化。对此种细胞获得率的研究发现,平均350ml脂肪抽吸物可分离出1×10~8。单个核细胞,数量非常可观,自体抽吸量可获得充足细胞,用于组织工程的研究。故本实验应用组织工程技术,选择可降解生物材料氧化异丙烯Plurolic—F127和透明质酸钠为支架材料,以人成纤维细胞和ADSCs为种子细胞,形成细胞--支架复合物,注射到裸鼠皮下构建软组织,为临床探讨一种更安全有效的除皱方法提供参数。二、材料与方法1、人皮肤成纤维细胞和ADSCs分离实验一皮肤来自于临床5名男性植皮患者,平均年龄22岁。实验二皮肤和脂肪来源于3名男性患者,2例为男孩,分别10岁和13岁,腹部取全厚皮及皮下脂肪,1例为24岁男性皮瓣修薄术的残留皮肤和脂肪。以无菌手术分离皮肤和皮下脂肪组织。胶原酶消化皮肤和脂肪,分离收集原代皮肤成纤维细胞和ADSCs置DMEM培养液传代,收集第2代细胞作为种子细胞。ADSCs按4×10~5有核细胞/cm~2细胞密度接种于培养皿内,常用的100mm塑料培养皿接种细胞3×10~7左右,加入低糖DMEM+10%FBS培养液培养,传代收集第2代细胞作为种子细胞和检测。2、细胞一生物支架复合物制备、植入和取材:30%plurolic—F127和透明质酸钠为支架材料,和种子细胞混合制成细胞-生物支架复合物,实验一分两组:组①plurolic—F127和成纤维细胞混合;组②单纯成纤维细胞组。按每一样本0.2ml注射到裸鼠(5只,雌性)背部皮下,形成4个点,每组各2个点,8周后取材,用于检测与分析。实验二分四组:组①成纤维细胞按25×10~6个/ml浓度与稀释后透明质酸钠混合:组②ADSCs按25×10~6个/ml浓度与稀释后透明质酸钠混合;组③成纤维细胞和ADSCs分别按12.5×10~6个/ml浓度与稀释后透明质酸钠共混合;组④单纯透明质酸钠设为对照组;按每一样本0.2ml注射到裸鼠(6只,雌性)背部皮下,形成4个点,每组各1个点,8周后取材,用于检测与分析。3、将取材获得的标本,分别从大体、体积、组织学等方面,对形成组织进行评价重量和体积;免疫组织化学检测形成的组织是否含有I型胶原:RT-PCR方法检测构建的组织的人Y染色体三、结果1、大体观察和分析:8周后取材,实验一两组均未发现有任何结节形成或残留,实验二6只裸鼠1只死亡,存活的5只裸鼠皮下注射的实验组样本,均形成了非常好结节状软组织,柔软有弹性,对照未有任何结节形成或残留。2、体积测定:实验二组①的平均体积(0.020±0.007)ml,占注射时样本体积的10%;组②的平均体积(0.037±0.094),占注射时样本体积的18.5%;组③的平均体积(0.035±0.012)ml,占注射时样本体积的17.6%。采用单因素方差分析示三组数据有统计学意义(F=5.145,P=0.024);组间采用LSD分析示实验组①的体积和组②、组③之间均有显著差异(P＜0.05);而组②和组③的体积之间无统计学差异(P＞0.05)。3、组织学检测:实验二结果HE染色示实验组①、②和③体内形成的组织周边有纤维组织包裹,纤维组织中有少量炎性细胞侵润,中间组织排列紊乱,生物材料完全降解,无新生血管长入;Masson三色染色能将胶原纤维染成绿色,弹性纤维染成棕色,肌纤维染成红色,胞核呈兰黑色,显示实验组①、②形成的组织周边有少量的胶原纤维,中间无胶原纤维;而实验组③形成的组织周边有少量的弹性纤维或肌纤维,中间有大量排列紊乱的胶原纤维:Oil Red染色示脂肪组织为红色,显示实验组①、②和③形成的组织周边有少量的脂肪,中间无脂肪组织。4、I型胶原免疫组织化学检测结果示实验组①、②和③体内形成的组织工程化组织内均未含有明显的I型胶原存在。5、RT-PCR方法检测构建的组织的人Y染色体:结果显示实验二实验组①、②和③体内形成的组织工程化组织和阳性对照组均得到294bp和494bp二条带,表明实验组所形成的组织为植入的细胞-生物支架复合物所形成。四结论应用组织工程技术,可降解生物材料氧化异丙烯30%Plurolic—F127为支架材料,人成纤维细胞为种子细胞,以25×10~6细胞/ml混合,裸鼠皮下不能构建出有形的组织。但应用透明质酸钠为支架材料,能构建出组织工程化软组织。应用组织工程技术,透明质酸钠为支架材料,以人脂肪干细胞(ADSCs)或成纤维细胞为种子细胞,能构建出相当好的组织工程化软组织,且脂肪干细胞(ADSCs)为种子细胞更有优势,这为临床寻找一种安全有效的除皱新方法提供了新的研究方向。