论文部分内容阅读
背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)是机体的初级感觉神经元,是传入纤维介导的外周信号向脊髓及以上中枢神经系统传递的第一站。并且,在很多的慢性疼痛的条件下,DRG对外周神经过度兴奋起着重要的作用。γ-氨基丁酸(GABA)作为神经系统中重要的抑制性神经递质,其参与的痛觉的传递和调控成已为人们充分认识。以往人们认为,GABA抑制系统仅存在于中枢神经系统中,而外周神经纤维或神经节没有GABA的来源。但研究证实,DRG神经元胞体中不但含有高表达的GABA受体,而且在培养或者急性分离的DRG神经元胞体中检测到非常大的GABAA Cl-电流。那么这些存在于DRG神经元胞体的GABA受体是否只能转运到脊髓背角中枢突末梢才能接收那里的GABA信号而发挥痛觉传递的调节功能?在此,我们提出DRG上可能存在着一个完整的功能性局部GABA能循环理论。虽然研究发现DRG神经元上分布大量的GABA受体,然而DRG中组成GABA能传递的其他关键组分的表达并没有充分的文献记载。本文将对GABA能回路的关键组分在DRG神经元的表达与分布、DRG中GABA的释放进行充分的研究证明。并且通过制备神经病理性疼痛模型坐骨神经慢性挤压损伤(chronic constriction sciatic nerve injure,CCI)和坐骨神经切断(sciatic nerve transaction,SNT)模型,观察 DRG 神经元上 GABA能系统各组分分子mRNA在神经痛的发生中的变化,为以后临床治疗慢性疼痛提供新的途径。第一部分背根神经节GABA能回路组分的表达以及GABA释放的研究目的:(1)确定DRG中谷氨酸脱羧酶(GAD)、GABA转运体如囊泡GABA转运体(VGAT)以及细胞膜转运体(GAT1-3),以及各GABA受体亚型的表达。(2)检测急性分离的完整的大鼠DRG GABA的释放,并探究其释放机制。方法:实时定量PCR(qPCR)技术;冰冻切片-免疫荧光技术;高效液相色谱法(HPLC)。结果:(1)在大鼠DRG利用qPCR技术,我们检测到了 GABAA受体的多种α,β和γ亚基的mRNA表达,其中α1-3和γ2亚基表达特别高。在DRG中,我们也检测到GAD67,GAT1-3以及VGAT的表达,虽然比脊髓表达要低。在GAT中,GAT1的表达最高。而DRG中并没有检测到GAD65的表达。(2)在免疫荧光的实验中,我们观察到GABAA受体的α1,α4和β2亚基蛋白在大鼠DRG神经元中有高水平免疫反应。同时,我们发现在许多不同大小的神经元中,VGAT与GAT1都有表达,并且发现GAT1在胶质细胞中也有表达。(3)在新鲜提取的完整大鼠DRG中,细胞外液高K+孵育DRG能刺激释放大量的GABA;GAT1的抑制剂N0711(200μM)本身显著地增加GABA的释放,并且还能够部分地降低高K+引起的GABA的释放;囊泡传递(VGAT)抑制剂ConA(0.5μM)以及破伤风(10μg/ml)都能几乎完全抑制高K+诱导的GABA的释放。结论:通过实时定量PCR,免疫荧光,高效液相色谱法验证了大鼠DRG存在GABA能回路,拥有生产、释放、回收GABA的功能。囊泡以及非囊泡抑制剂对GABA释放都有影响,说明在DRG中GABA也通过传统的囊泡传递以及GAT1的逆转运这两种机制释放。第二部分GABA能回路关键组分mRNA表达水平在神经损伤后的变化目的:在神经损伤所致神经病理性疼痛条件下,观察GABA能回路的关键组分相应mRNA表达的变化,探讨DRG GABA回路参与疼痛发生的分子机制。方法:制备大鼠神经病理性疼痛模型CCI和SNT。应用热刺痛仪和Von Frey纤维刺痛针,测定大鼠热痛、刺痛阈值。利用实时定量PCR(qPCR)的方法检测GABA能回路的关键组分mRNA在神经损伤前后表达的变化。结果:(1)实验组CCI和SNT与对照组Sham相比,术后1天,两组动物的机械痛阈均开始显著性下降,机械痛觉过敏一直持续至术后第14天(P<0.05);热痛阈值只有CCI组有明显的下降,持续至术后第14天(P<0.05)。(2)GABA能回路的关键组分相应mRNA表达,在手术的第五天,CCI组α1 γ2,GAD67的表达下调,α2,α5,β1,GAT2的表达增加;SNT组α1,丫2的表达下调,α5,β1 β3,GAT2,GAT3的表达增加。在手术第十四天,CCI组α1 α2,β2,γ2,γ3,GAT2,GAD67的表达下调,α5 的表达增加;SNT 组α1,α2,γ2,γ3,GAT1,GAT3,GAD67,Bl,B2的表达下调。上述基因表达的上调或下降都有统计学意义(P<0.05)。结论:成功建立CCI与SNT大鼠神经病理性疼痛模型,并发现在两模型组中DRG GABA能回路的多种分子的mRMA表达水平发生变化,其中以GABAA受体的α1,γ2的表达下调最为明显。DRG GABA能回路可能在神经病理性疼痛中发挥重要作用。