番茄(Solanum lycopersicum)是世界上最受欢迎的水果之一,也是非常重要的蔬菜之一。番茄为茄科番茄亚属一年生草本植物,原产南美洲的安第斯山地区,明代时期传入中国。器官脱落是植物中一种普遍的现象。植物器官脱落发生的特定区域叫做离区。尽管人们对于植物器官脱落发生的生理生化过程有了较为深入的研究,但是该领域的分子生物学进展还知之甚少。番茄以其独特的花柄离区结构而成为研究器官脱落的理想的模式植物。本文以番茄花柄为材料,采用基因芯片技术对番茄离区特异基因及离区组织的乙烯反应转录谱进行了分析。对离区特异上调表达基因SlWUSCHEL采用过表达技术对其进行了功能研究,并且在酵母双杂交的基础上,对与番茄的离区发育基因JOINTLESS相互作用的MADS-box基因运用RNAi技术进行了功能研究。此外,对JOINTLESS的启动子进行了较为系统的研究。主要研究结果如下:(一)为了对器官脱落发生过程中离区特异转录谱有更加全面和深入的认识,本实验利用Affymetrix公司的番茄基因芯片对番茄花柄离区及其侧翼组织的转录谱进行了分析。得到以下结论:(1)共找到番茄花柄离区特异上调表达的基因72个,其中有8个转录因子,下调表达的基因23个,其中有1个转录因子。(2)番茄花柄部分以离区为分界线,上下两部分对乙烯的反应呈现不同的敏感度,靠近花的离区组织(F)比靠近根的离区组织(R)表现出较强的乙烯反应,我们称之为“阀门效应”(valve effect)。(3)在番茄花柄对乙烯应答的1472个基因中,生理功能、细胞过程以及催化活性的三类基因共占总应答基因的60%。(二)对基因芯片分析中找到的番茄离区特异表达的SlWUSCHEL基因,进行了RT-PCR验证之后,在拟南芥中过量表达进行功能研究。结果如下:(1)我们对克隆到的番茄SlWUSCHEL基因经过重复验证之后,发现NCBI的SlWUSCHEL基因的mRNA和蛋白序列分别有三个碱基的差异和一个氨基酸的差异。同时对该基因的结构进行了分析,发现含有两个内含子,与拟南芥中的WUSCHEL基因结构类似。(2)番茄WUSCHEL和拟南芥的WUSCHEL蛋白序列一致性仅有36%,但是番茄的SlWUSCHEL可以在拟南芥中起着拟南芥WUSCHEL类似的功能,表明该类蛋白的同源异型结构域可能是蛋白发挥功能的重要部分。(3)转基因植株的表型分析结合扫描电镜分析显示过量表达番茄SlWUSCHEL在植物的花序结构和花分生组织的有限性生长方面发挥重要功能。(4)在有些过量表达植株中,转基因株系的分枝处发生了新器官的形成,新器官的发生是在类似离区的部位形成,暗示了SlWUSCHEL基因离区的发育中起着一定的作用。(三)为了对番茄离区发育过程中关键基因进行挖掘和功能研究,对酵母双杂交筛选出来的与JOINTLESS相互作用的番茄MADS-box基因做了RNAi功能敲除实验。同时对JOINTLESS进行了过表达实验。结果如下:(1)构建了7个MADS-box基因的RNAi载体和JOINTLESS过表达载体。得到了各种RNAi转基因阳性植株共29株,大多数转基因植株得到了RT-PCR的验证。其中有重要表型变化的三个基因,分别是TAG1,JOINTLESS,SLMBP20。(2)TAG1严重影响了番茄花的雄蕊和雌蕊的发育,雄蕊形态异常、不育,有的植株雄蕊消失,而雌蕊则失去了有限性,变成了类似于多个心皮组成的花椰菜状组织。(3)番茄的JOINTLESS过量表达植株显示花序增生,而且过表达的果实形状呈现椭圆形。表明番茄JOINTLESS是一个与花序发育和果实形状发育有关的转录因子。(4)在SLMBP20 3023 RNAi的转基因植株中,花序显示花、叶、花、叶重复出现的异常表型,表明SLMBP20在花序结构发育中发挥重要作用。(四)为了揭示番茄离区决定基因JOINTLESS的启动子含有的两个反向重复序列TAPIR在JOINTLESS基因表达中的可能功能,对启动子进行了全面分析,分别构建含有2个、1个TAPIR和不含TAPIR元件的大小不同的启动子,启动子融合GUS报告基因来验证TAPIR对JOINTLESS基因表达的影响。结论如下:(1)番茄中的三个启动子的表达模式没有本质的区别,表明TAPIR元件并不影响JOINTLESS的表达。(2)三个启动子的表达分布于番茄发育的多个阶段,表明JOINTLESS除了在花柄离区发育中有重要功能,可能在番茄的其他发育过程中也担当着重要的角色。(3)三个启动子在拟南芥的表达模式清晰而稳定,说明TAPIR在拟南芥中是一个重要的调控基因转录表达的顺式元件。TAPIR元件对于番茄和拟南芥有着完全不同的影响,可能反应了随着进化植物基因调控机制在不同物种间呈现多元化。综上所述,结合JOINTLESS启动子的研究结果、JOINTLESS过表达转基因植株的表型分析以及前人的研究结果,本实验得出结论:JOINTLESS除了决定番茄花柄离区的发育之外,还参与花序的结构、果实形状、种子发育等生物学过程。