目的:鲍曼不动杆菌(A.baumannii)是医院内感染的常见细菌,在临床分布广泛,具有较高的检出率;分子分型方法如ERIC-PCR(enterobacterial repetitive intergenic consensus PCR),PFGE(pulsed-field gel electrophoresis),MLST(Multi locus sequence typing)等已广泛用于临床菌株爆发流行事件的调查。鲍曼不动杆菌的耐药性也一直是临床工作者关注的焦点。替加环素(tigecycline)是目前针对临床耐药菌的有限选择之一,但面临鲍曼不动杆菌对其耐药率有上升的风险。本研究对2017年5月至2019年3月在江苏大学附属医院分离的临床鲍曼不动杆菌进行分子分型,据分型结果和菌株的时空分布判断其院内感染的爆发流行与克隆传播情况,为进一步加强院内感染的防控提供帮助。同时,分析临床菌株的耐药谱,检测耐药相关分子如AdeB,TetB和AbaQ等在菌株间的分布情况,探讨耐药表型与耐药相关分子的关系。在此基础上,进一步分析替加环素对部分鲍曼不动杆菌临床菌株耐药表型和耐药相关分子表达的影响,寻找替加环素压力下优势表达的耐药基因。此外,利用基因组和转录测序技术分析临床上经替加环素治疗后耐药性增强的一对菌株,寻找替加环素压力下致鲍曼不动杆菌耐药表型发生变化的原因,为减缓耐药率的上升速率提供应对策略。方法:(1)以ERIC-PCR为主要方法对样本菌株进行基因分型,结合菌株的时空分布,判断特定时期内鲍曼不动杆菌的院内爆发流行与克隆传播情况,并以分子分型的“金标准”PFGE对其中耐药率相对较高的35株菌株进行分型,与ERIC-PCR分型结果作比较,验证ERIC-PCR对鲍曼不动杆菌的分型能力。(2)以PCR结合琼脂糖凝胶电泳的方法,检测所有样本菌株外排泵基因AdeB、AdeG、AdeJ、TetB、CraA、AbaQ、AbeM、MacB、AbeS和调节蛋白基因AdeR、AdeS、BaeS和SoxR的携带率,进行卡方检验,比较敏感菌株与耐药菌株外排泵和调节蛋白携带率的差异,并探讨外排泵携带与菌株分子分型的关系。(3)根据菌株耐药谱、分型结果和外排泵携带情况,选定6株鲍曼不动杆菌,测定各菌株对替加环素的MIC值。在LB液体培养基中进行替加环素浓度梯度增加的体外诱导实验(实验组),同时以各菌株的LB纯培养作为自身对照(对照组),测定经诱导和LB纯培养后各菌株对替加环素的MIC值。提取各菌株的总RNA,去基因组后逆转录定量检测耐药相关基因和管家基因的CT值,以各自LB纯培养菌株作为参照,计算各菌株经替加环素体外诱导后外排泵与调节蛋白基因的相对表达量。(4)通过对样本菌株前期工作的分析与患者病历的查询,选取源于同一患者,且在临床应用包括替加环素在内的抗菌药物治疗后,对替加环素和米诺环素的耐药性由敏感转变为耐药的一对鲍曼不动杆菌。按临床检出顺序将它们分别命名为A.baumannii 711(AB711)和A.baumannii 721(AB721),复测菌株的耐药性。在体外对AB711进行替加环素浓度梯度增加的体外诱导实验,以期复制临床耐药性发生变化的过程,并记录经诱导后对替加环素的MIC值。将经诱导后的菌株命名为A.baumannii 712(AB712),并对上述三个菌株进行基因组DNA的提取及全基因组测序和分析。对AB711和AB712进行RNA的提取与转录测序分析,根据基因差异表达结果选取部分基因进行逆转录定量PCR(RT-qPCR),将定量PCR的结果与转录测序的结果进行比较。结果:(1)采用ERIC-PCR对183株鲍曼不动杆菌进行同源性分析,共分为45个克隆群。A、D、F、I、J等为主要分群,结合菌株的时空分布进行分析,未发现特定克隆群的爆发流行迹象。此外,应用PFGE与ERIC-PCR对其中35株鲍曼不动杆菌进行分子分型,结果显示ERIC-PCR与PFGE对此35株菌株分型结果部分相一致,表明ERIC-PCR对鲍曼不动杆菌基因型具有一定的分辨能力。(2)外排泵AdeG总携带率高达98.36%,调节蛋白BaeS总携带率为96.17%。外排泵TetB的总携带率最低,为78.14%。除外排泵基因AdeG、AdeJ和AbaQ在耐药和敏感菌株间检出率无明显差异,其它外排泵和调节蛋白基因在耐药株细菌中检出率均高于敏感菌株,经卡方检验,p<0.05,差异具有统计学意义。本次检测的各耐药相关分子,在ERIC-PCR克隆群中均有分布。(3)对照组的多药耐药菌与广泛耐药菌外排泵基因(AdeB、TetB、和AbeS)及调节蛋白基因AdeS的表达较敏感组菌株明显升高;在广泛耐药株,外排泵基因(AdeB、TetB)的表达较多药耐药株偏高,结果经t检验P<0.05。其它各耐药相关基因在多药耐药与广泛耐药株细菌中表达各异。与对照组比较,实验组中AdeB、TetB、AbaQ和AdeS在各临床分离菌株的表达均呈上升趋势,其中AdeB和TetB的表达均明显升高(P<0.01)。其它基因如AbeM、MacB、AbeS、BaeS和AdeR的表达存在菌株间的差异。(4)在替加环素浓度梯度升高的培养条件下,AB711对替加环素的MIC值升高两个倍比稀释度,而转入无替加环素压力的体外培养后,其对替加环素的MIC降至原水平。这一变化与AB711对替加环素耐药性变化的临床过程相似。全基因组测序(WGS)与MLST分型结果显示,AB711、AB712和AB721同属于ST2(Pasteur)/ST1791(Oxford);基于SNP的进化树分析表明,AB711、AB712和AB721系同源。在替加环素的压力下,菌株的差异表达基因功能富集分析表明,与含苯化合物和含酚化合物代谢过程有关的基因,以及翻译、核糖体生物合成、氨基酸转运和代谢等相关基因表达均明显上调。此外,RND家族外排泵亚基、EmrAB、MacB和四环素操纵子等基因的表达也上调。对部分基因的RT-qPCR检测结果与转录差异表达结果基本一致。结论:(1)通过对鲍曼不动杆菌临床分离菌株的分析发现,存在院内感染的克隆传播现象,但无特定基因型的鲍曼不动杆菌爆发流行迹象。(2)多种外排泵的携带与表达可能在鲍曼不动杆菌耐药性形成过程中具有重要的作用。(3)RND家族外排泵基因AdeB和四环素操纵子中的TetB的高表达,可能在鲍曼不动杆菌对替加环素耐药性增强的过程中具有重要作用。(4)在体外培养或临床用药过程中,鲍曼不动杆菌在替加环素压力下,可通过直接上调耐药相关基因的表达,或改变生物合成或代谢相关基因的表达,导致对替加环素耐药性的演变,其具体的分子机制有待进一步研究。