论文部分内容阅读
背景:Bmal1是一种重要的生物钟基因,它在肌肉和大脑中都高度表达。有研究发现,生物钟基因对于维持骨骼肌的成熟具有关键作用,Bmal1基因缺失会造成多种生理功能的改变,但是其对于骨骼肌的具体作用仍不明确。目的:本研究旨在探讨Bmal1在肌肉再生中的作用。方法:利用全身敲除Bmal1基因的小鼠为研究对象,探究Bmal1在肌肉维持和再生中的作用。测量Bmal1-/-小鼠和Bmal1+/-小鼠的体重,以观察Bmal1的缺失对小鼠的体重是否有影响。为了进一步探究Bmal1基因对小鼠的成肌能力是否有影响,对Bmal1-/-小鼠和Wild Type小鼠进行腓肠肌冰冻切片免疫荧光染色,以确定Bmal1的缺失是否对肌纤维的比例和横截面积(CSA)有影响。然后从Bmal1-/-小鼠和Bmal1+/-小鼠的胫骨前肌中分离卫星细胞,比较它们在含有2%马血清的培养基中分化形成肌管的能力。使用BaCl2肌肉损伤模型,将BaCl2注射到Bmal1-/-小鼠和Wild Type小鼠的胫骨前肌中,以评估Bmal1在骨骼肌再生中的作用,并且进行了 eMyHC的免疫荧光染色用于鉴定损伤后新形成的纤维。为了鉴定受Bmal1调节的基因,我们对Bmal1-/-小鼠和Wild Type小鼠的卫星细胞进行芯片分析,并通过实时荧光定量PCR进一步验证与肌生成相关的差异表达的基因。结果:(1)持续饲养Bmal1-/-小鼠和Bmal1+/-小鼠,Bmal1-/-小鼠的体重始终低于Bmal1+/-小鼠。(2)腓肠肌冰冻切片免疫荧光染色的结果显示,与年龄和性别相同的Wild Type小鼠相比,Bmal1-/-小鼠中2a,2b和2x亚型肌纤维的平均横截面积(CSA)降低,而1型纤维的横截面积并无明显不同。另外,Bmall-/-小鼠中2a和2x型肌纤维的比例高于Wild Type小鼠。(3)Bmal1-/-小鼠和Bmal1+/-小鼠的卫星细胞形成的肌管数量相似,但Bmal1-/-小鼠的肌管长度和宽度显著低于Bmal1+/-小鼠,表明当Bmal1缺失时肌原性分化不完全。(4)为了评估Bmal1在肌肉再生中的作用,我们对胫骨前肌注射BaCl2溶液。注射5天后,新形成的中央核纤维(CNF)充满了 Wild Type小鼠再生的胫骨前肌。相比之下,Bmal1-/-小鼠的胫骨前肌显示出较差的再生迹象,体现在肌纤维横截面积(CSA)的减少,CNF的数量和每个视野含有超过1个中心核的肌纤维的数量显著减少。免疫组织化学结果分析显示,与相应的Wild Type小鼠相比,Bmal1-/-小鼠再生的肌肉中eMyHC+纤维的CSA较小。(5)芯片结果显示在Bmal1-/-小鼠中,肌肉生长抑制素(Mstn)的表达增加,但Smad3和Pax7的表达降低。通过实时荧光定量PCR验证了芯片结果。Mstn在Bmal1-/-小鼠卫星细胞中的表达量增加与我们的发现一致,即Bmal1缺失导致肌生成受损。结论:Bmal1在肌肉维持和再生中发挥重要作用,Bmal1的缺失导致卫星细胞分化延迟和肌肉再生受损。总之,我们首次证明了Bmal1和肌肉生长抑制素Mstn之间的潜在联系,并且我们的发现揭示了TGF-β信号通路在肌生成中的作用。