盐穗木金属硫蛋白基因HcMT的克隆及对拟南芥的遗传转化

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植物修复技术是用绿色植物来降低土壤中的重金属残留,并最后使之变为可回收利用且对环境无害的一种环境友好,有成本效益的修复技术。国内外研究发现,通过转基因技术,将外源基因在植物体内过量表达,可以促进植物吸收、运输及降解金属的能力,从而能够解决植物修复中大部分超富集植物生长慢和生物量小等问题。金属硫蛋白(Metallothioneins,MTs)是分子量低,富含半胱氨酸,与细胞的抗重金属中毒作用机制相关的金属结合蛋白。虽然有关哺乳动物MT转入植物的研究较多,但尚未见盐穗木MT基因转化其他植物的报道。为探究盐穗木金属硫蛋白基因转化植物后对重金属耐性机制的影响,本实验根据盐穗木MTs的EST序列设计特异引物,并以盐穗木植株为材料,通过RT-PCR克隆得到MT基因完整开放阅读框的cDNA序列(命名为HcMT),序列分析结果表明,该基因cDNA全长为411bp,包含234bp(包含一个起始密码子)的开放阅读框,82bp的5’-UTR和92bp的3’-UTR,编码78个氨基酸,其中半胱氨酸(Cys)的数量为14个,其分子量为7.70kD,等电点为5.05。生物信息学分析结果显示,盐穗木MT基因完全符合典型的MT2蛋白特征,盐穗木与其它植物的MT2具有较高的同源性,该基因的氨基酸序列与它们约有69%的同源性。系统发育树分析表明,HcMT和海蓬子的亲缘关系较近,氨基酸同源性达93%。蛋白家族的预测结果显示,本研究中的盐穗木MT蛋白属于MT II蛋白家族。半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR分析表明,HcMT基因在100mMCuSO4、ZnSO4、CdCl2胁迫下表达都明显上调,该基因受到重金属胁迫诱导,这些结果表明,HcMT基因对CuSO4、ZnSO4、CdCl2等重金属胁迫能够做出响应。为了确定盐穗木HcMT蛋白在植物中的定位,本实验构建了盐穗HcMT基因与绿色荧光蛋白基因(GFP)的融合亚细胞定位载pCAMBIA1302-HcMT-GFP,将为后续的进一步研究和应用奠定基础。同时,本实验构建了重组植物表达载体pCAMBIA1301.1-HcMT,并通过根瘤农杆菌花絮浸染法转化拟南芥,经过抗生素筛选获得了抗性苗,从而为研究HcMT基因在转基因植物中的功能和重金属耐性分子机制及应用研究奠定基础。
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