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采集健康猪血清,以辛酸-硫酸铵法提取猪IgG,利用Hiload16/60 superdex200预装凝胶柱对粗提猪IgG进行纯化,上样量2mL,流速0.2mL/min,收集不同洗脱峰进行SDS-PAGE电泳分析,以Bradford法测定纯化蛋白浓度,获得高纯度猪IgG蛋白。
用纯化的猪IgG蛋白为抗原免疫6-8周龄BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)在聚乙二醇作用下进行融合,以HAT培养基选择性培养后,经间接ELISA筛选和有限稀释法克隆化,获得8株稳定分泌抗猪IgG单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为2E11、3E12、4C10、5A4、5C11、5D7、6H3和7H1,其细胞上清和腹水ELISA抗体效价分别为1:320-1:6400和10-6-10-7。Ig亚类分析表明,除6H3为IgG2b外,其余7株均属于IgG1,轻链亚类均为κ。Western-blotting结果显示,单克隆抗体3E12、4C10和5C11识别猪IgG重链,其余5株单克隆抗体识别猪IgG轻链。以ELISA和Western-blotting测定单克隆抗体与其它动物IgG/IgY的交叉反应性,结果显示单克隆抗体2E11、5D7、5A4、6H3和7H1可识别鸭、鹅、斑头雁、鸬鹚等水禽IgY轻链的共同表位。ELISA抗体相加试验的表位分析表明,8株单克隆抗体共识别3个不同的抗原表位,分别命名为重链IgG-H1、轻链IgG-L1和轻链IgG-L2,其中3E12、4C10、5C11识别重链IgG-H1表位;5D7、7H1识别轻链IgG-L1表位;2E11、5A4、6H3识别轻链IgG-L2表位。
以辛酸-硫酸铵法和蛋白G柱亲和层析纯化7H1单克隆抗体腹水IgG,采用改良过碘酸钠法(不同的酶/抗体质量比)和戊二醛法对单克隆抗体进行辣根过氧化物酶(HRP)标记,对酶标抗体标记效果的测定表明,酶/抗体质量比为1:1的改良过碘酸钠法酶标效率最高,其酶标抗体克分子比为2.16,酶标记率为20.32％,直接ELISA效价为1:12800。酶标单克隆抗体检测猪血清抗体的间接ELISA和Western-blotting最佳工作浓度分别为1:2000和1:10000;对临床血清的检测表明,酶标单克隆抗体与酶标多克隆抗体对猪圆环病毒2型和流感病毒抗体的ELISA检测符合率分别为95.55％和100％。本研究制备的酶标抗猪IgG单克隆抗体为猪病的免疫诊断试剂研究和猪细胞生物学研究提供了一种基础工具。