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目的探讨两种天然免疫细胞,浆细胞样树突状细胞(Plasmacytoid Dendritic Cell, pDC)和自然杀伤(Natural Killer, NK)细胞的相互作用及机制;研究HIV/HCV单感染以及共感染对pDC-NK细胞间作用的影响,为了解HIV和HCV两种病毒感染的相互作用提供新信息。方法1.利用健康人的pDC、NK细胞研究pDC-NK相互作用的机制:利用磁珠法分离pDC和NK细胞,建立pDC-NK细胞体外培养系统,确认系统内两种细胞在体外被激活时相关因子(IFN-α、 IFN-γ、Perforin、Fasl、Granzyme-B)的表达以及细胞间作用;进行transwell试验,探讨pDC-NK细胞直接接触在细胞系统激活中的作用;2.利用感染人群(HIV单感染,HCV单感染,HIV/HCV共感染)及健康对照人群研究病毒感染对pDC-NK细胞相互作用的影响:采集病毒感染人群的血样样本,分离pDC和NK细胞,在不同感染组分别进行pDC-NK细胞系统激活试验,通过与健康人群组相比,分析病毒感染对pDC-NK细胞系统的影响。结果1.pDC-NK细胞系统的激活机制1.1 pDC可在体外条件下被激活并大量释放IFN-α:向新鲜分离的pDC中加入TLR-9受体激动剂ODN2216,对照组用ODN2243处理。ODN2216处理组的IFN-α mRNA表达显著高于ODN2243对照组,差异有统计学意义(p<0.01)。1.2体外条件下,NK细胞可经由TLR-9通路激活的pDC细胞达到激活状态,表达相关细胞因子:使用ODN2216处理新鲜分离的NK细胞,结果表明 NK 细胞相关细胞因子(IFN-γ、Perforin、Fasl、Granzyme-B)在 mRNA水平上表达没有明显变化(P>0.05)。但在加入ODN2216的同时,按NK细胞数量10:1的比例加入少量pDC后,上述NK细胞相关因子在mRNA水平上的表达显著上升(四个因子的表达与ODN2243对照组相比,p<0.05)。1.3 pDC与NK细胞直接接触不是NK细胞激活的主要因素:在上述试验的基础上进行transwell试验,transwell培养法使细胞在不能直接接触但能保留培养液互通的条件下进行培养。结果表明,在没有直接接触的条件下,NK细胞依旧可以被激活(Perforin、Fasl、Granzyme-B的表达上调,与ODN2243对照组相比,p<0.05)。直接比较ODN2216处理的transwell共培养和直接接触共培养组(不使用transwell),结果显示在无细胞直接接触的条件下,NK细胞相关因子的表达没有显著性的变化(p>0.05)。2.HIV/HCV单感染与共感染对pDC-NK细胞系统的影响2.1 HIV单感染上调pDC IFN-α mRNA的本底表达,即HIV单感染组pDC空白组(未经ODN2216体外激活)(198.98±10.74)与健康人群组pDC空白组IFN-αmRNA相对表达量相比,出现显著性的升高(p<0.01);但是pDC激活组(ODN2216体外激活),HIV单感染组IFN-α mRNA相对表达量(185.69±16.63)明显低于健康人群 pDC 激活组(240.08±28.26)(p<0.01),HIV可能损害了 pDC的TLR-9通路的体外激活。同时,HIV感染pDC-NK细胞系统ODN2216激活组Granzyme-B mRNA水平的表达(67.20±20.37)与健康人群激活组(1.21±0.31)相比,表达有上升趋势(p<0.01)。2.2HCV单感染上调pDCIFN-αmRNA的本底表达(44.23±8.80),同时,HCV能促进pDC经TLR-9途径激活表达IFN-αmRNA,跟健康人群pDC激活组相比,相对表达量有上升趋势(474.53±10.62vs 249.08±28.26)(p<0.01)。HCV单感染组pDC-NK细胞系统的部分因子的本底表达下降(IFN-γ:0.44±0.51,Fasl : 0.52±±0.28),而 Granzyme-B 本底表达量上升(59.21±26.34)(p<0.05)。HCV感染影响了 pDC-NK细胞系统本底水平的相互作用。2.3.HIV/HCV共感染时与HIV/HCV单感染类似,pDC IFN-α mRNA的本底表达高于健康人群的本底表达(567.51±59.50, p<0.01); HIV/HCV共感染也能促进pDC经TLR-9途径激活表达IFN-α mRNA (567.51±59.50 vs 249.08±28.26, p<0.01)。同时,HIV/HCV共感染能够提高pDC-NK细胞系统相关因子的本底表达。结论本研究成功建立了 pDC-NK细胞体外培养及激活系统,在体外通过TLR-9通路激活pDC后,通过活化的pDC所分泌的多种细胞因子激活NK细胞。本研究表明pDC-NK细胞间相互作用也不是通过细胞间的直接接触引发,而是通过pDC细胞产生的一系列细胞因子引发。本研究进一步探讨了 HIV和HCV单感染和共感染对体外pDC-NK细胞系统的影响,发现HIV和HCV单感染及共感染均可造成体内的pDC细胞处于一定的激活状态,但HIV单感染可损害pDC的TLR-9通路的体外激活,进而损害pDC-NK细胞相互作用,而HCV单感染则增强了 pDC的TLR-9通路的体外激活,进而影响到pDC-NK细胞间的相互作用。在HIV/HCV共感染条件下,pDC-NK细胞系统的体外激活类似于HCV单感染,HIV/HCV共感染也能促进pDC经TLR-9途径激活,进而影响到pDC-NK细胞的相互作用。