vlf-1是杆状病毒AcMNPV的核心基因之一,也是病毒感染的必需基因,其同源序列存在于所有已测序的杆状病毒中。最初的研究发现该基因编码的蛋白影响极晚期基因的超表达,因此命名为极晚期表达因子1(very late expression factor 1,VLF-1)。后来研究发现VLF-1对病毒核衣壳形成是必需的,该基因缺失突变病毒能观察到空管状衣壳鞘结构,表明VLF-1参与了病毒核衣壳的组装。vlf-1突变病毒的基因组DNA能被DNA酶完全降解,而其他某些病毒基因缺失也产生空管状衣壳鞘的病毒,其病毒基因组DNA有大约35%被保护而不被DNA酶降解,这表明VLF-1可能参与调控病毒基因组DNA的包裹。另外,VLF-1作为核衣壳结构蛋白,定位于核衣壳的末端。因此,VLF-1在病毒DNA加工、包裹和核衣壳组装的最后阶段有关键作用。本实验从两个方面对VLF-1的功能进行更深一步的研究。一、通过对VLF-1蛋白结构的预测,依据保守型结构域、整合酶家族结构域、DNA断裂-再连接酶结构域以及蛋白、DNA、RNA结合位点对vlf-1基因序列进行针对性的截短,在Bac-to-Bac系统中构建了十二个截短型和拯救型重组杆状病毒质粒并转染Sf9细胞,使用光学显微镜、荧光显微镜观察重组病毒在细胞中的复制情况,分析截短型VLF-1对病毒复制的影响。二、通过酵母双杂交的手段,构建AcMNPV感染的Sf9细胞总cDNA文库,利用结合法筛选,再利用缺陷型培养基逐步验证与VLF-1互作的蛋白。在得出初步结果后利用CO-IP、双分子荧光互补等技术,进一步验证互作蛋白。最后通过亚细胞定位等方式来探究其在细胞中互作的位置。以此来探究VLF-1调控病毒核衣壳组装及极晚期转录的机制。实验结果表明,在一系列截短型重组病毒中,碱基序列为1-1044 bp的截短型在Sf9细胞中的复制和感染情况与野生型和拯救型类似,说明其关键功能域存在于该区域。而在互作蛋白的筛选中,初步筛选出19种可能与VLF-1互作的蛋白,并挑选出以下由AcMNPV编码的蛋白:39K(Ac36)、VLF-1(Ac77)、CG30(Ac88)、VP39(Ac89)、LEF-5(Ac99)、P6.9(Ac100)、ME53(Ac139),进行深入验证。验证结果表明 39K(Ac36)、CG30(Ac88)、LEF-5(Ac99)与VLF-1存在互作。亚细胞共定位实验表明,39K与VLF-1共定位于细胞核。亚细胞定位实验表明,39K定位于细胞核;CG30定位于细胞核膜;LEF-5定位于细胞核。其中,39K是一个能与单链和双链DNA结合的蛋白;CG30含有一个锌指和亮氨酸指的结构,删除该蛋白后病毒的滴度急剧下降;LEF-5是一个晚期表达因子,含有一个类似于RNA聚合酶II延伸因子(TFIIS)的结构域,主要功能是调节晚期基因转录。我们推测VLF-1可能通过与39K相互作用参与病毒DNA的加工;通过与CG30的互作参与核衣壳的组装;通过与LEF-5的互作调控极晚期基因的超表达。其具体的作用机制仍有待阐明。